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强抗原决定簇hAFP542-550在真核细胞膜定位表达研究
目的:构建包含甲胎蛋白强抗原决定簇hAFP542-550、 EGFP 和GPI锚定蛋白GPC3三者组成的融合蛋白GPC3-hAFP542-550-EGFP表达质粒pGPC3-EGFP, 确定其定位表达在真核细胞膜上, 以强化靶细胞的免疫原性.方法:①采用RT-PCR方法从人胎盘组织总RNA中调取GPC3基因, 化学合成基因片段-KOZAK-GPCN+afp542-550-, 并从pEGFP-N1质粒中扩增EGFP基因, 三者嵌合构建融合蛋白的表达质粒pcDNA3.1(+)/GPCN+afp542-550-EGFP-GPCC(pGPC3-EGFP);②以Lipofectamine 2000转染质粒pGPC3-EGFP 入肝癌细胞株HepG2(GPC3+AFP+), 转染后24 h和48 h引物GPCN-F和EGFP-r RT-PCR及Western blot检测融合蛋白GPC3-hAFP542-550-EGFP表达;③对照质粒pEGFP-N1和pGPC3-EGFP转染HepG2, 荧光显微镜观察比较两种质粒EGFP蛋白表达的部位;pGPC3-EGFP转染人胚肾HEK293细胞(GPC3-AFP-), 提取细胞膜蛋白和可溶蛋白Western blot检测融合蛋白表达.结果:①成功构建pGPC3-EGFP质粒;②融合蛋白可在 HepG2中表达;③与pEGFP-N1不同, 融合蛋白主要在胞膜上出现荧光反应, 胞质内仅见散在零星荧光;转染后HEK293细胞的膜蛋白中检测到融合蛋白表达, 而可溶蛋白中未检出.结论:pGPC3-EGFP可以在真核细胞中表达, 表达的融合蛋白GPC3-hAFP542-550-EGFP仍然定位表达在细胞膜, 是一种新型GPI再锚定蛋白.
