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慢病毒介导的Canstatin基因转移对脐静脉血管内皮细胞增殖与凋亡的影响
目的:构建携带Canstatin基因的慢病毒载体,体外转染脐静脉血管内皮细胞ECV304,观察其体外培养的脐静脉血管内皮细胞增殖及凋亡的影响.方法:应用基因重组技术构建慢病毒载体表达质粒pGC-FU-Canstatin,通过酶切、测序验证Canstatin基因后,将pGC-FU-Canstatin质粒和包装质粒pHelper 1.0,pHelper 2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带Canstatin基因重组慢病毒GC-FU-Canstatin,并测定病毒滴度.将重组慢病毒转染靶细胞人脐静脉血管内皮细胞ECV304,通过Western blotting检测靶细胞中Canstatin的表达.采用 MTT法观察 Canstatin基因对人脐静脉血管内皮细胞 ECV304的体外细胞增殖的影响.TUNEL染色、流式细胞仪 AnnexinV /碘化丙啶双染法,检测慢病毒介导的 Canstatin基因诱导脐静脉血管内皮细胞的凋亡.结果:pGC-FU-Canstatin中携有正确的Canstatin基因序列; pGC-FU-Canstatin和包装质粒pHelper 1.0,pHelper 2.0共转染包装细胞293T产生重组病毒GC-FU-Canstatin;检测病毒滴度为1×109TU/ml;Western blotting检测到Canstatin蛋白在靶细胞中持续表达.Canstatin(感染复数分别为25和50)作用72h后,ECV304细胞增殖数目 显著少于PBS组和空载体组(P<0.01);TUNEL染色,以MOI为25的重组慢病毒GC-FU-Canstain作用于人脐静脉血管内皮细胞ECV304细胞72h后,出现典型的凋亡形态学改变.以感染复数为25的GC-FU-Canstatin处理ECV304细胞72h后,细胞凋亡率为(21.63±1.32)%,PBS组为(2.87±0.76)%,空载体组为(2.66±0.69)%,转基因组与空载体组、PBS组相比差异均有显著统计学意义(P<0.01).结论:慢病毒介导的Canstatin基因可显著抵制人脐静脉血管内皮细胞ECV304的体外增殖,同时对人脐静脉血管内皮细胞的凋亡具有促诱导作用.
关键词： Canstatin基因 慢病毒 凋亡 基因治疗
