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表达免疫印迹文献资料
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肝癌中蛋白激酶CK2α亚基的克隆及其功能初步研究
目的克隆肝癌中CK2α基因,并研究其功能.方法通过逆转录PCR从肝癌组织中获得CK2α亚基基因编码区cDNA.将NdeI/BamHI 双酶切PCR产物连接到同样双酶切并经牛小肠碱性磷酸酶去磷酸化的表达载体pT7-7 进行定向克隆.转化感受态大肠杆菌DH5 获得转化子,琼脂糖凝胶电泳初步筛选转化子,将阳性克隆进行单和双酶切分析鉴定.随机挑选4个阳性克隆进行DNA测序,将序列完全正确的重组质粒转化表达菌BL21(DE3),挑单克隆小量培养,IPTG诱导表达,Western blot 鉴定.结果转化子的阳性筛选率为100%,限制性酶分析结果表明,插入片段和重组质粒的大小与理论推测值相符.DNA正反向测序结果表明:从4个阳性克隆中筛选到1个PCR过程不产生突变的重组质粒,并将其质粒命名为pTMCKA.重组质粒转化表达菌经TPTG诱导后出现一个分子量42Kda 蛋白过度表达,Western blot 结果证明过度表达产物能与抗人 CK2α亚基抗体发生特异性免疫反应.结论蛋白激酶CK2α亚基在肝癌中表达,并产生一定的功能.
关键词： 催化亚基/蛋白激酶CK2α 肝癌 分子克隆 DNA测序 表达免疫印迹
