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大鼠VGLUT2基因shRNA慢病毒载体转染原代培养脊髓神经元对VGLUT2表达的影响
目的:探讨新构建的可以表达针对2型囊泡膜谷氨酸转运体(vesicular glutamate transporter 2,VGLUT2)短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)的慢病毒载体能否有效地感染大鼠脊髓原代培养神经元,并鉴定其对培养神经元内VGLUT2基冈的特异性干扰效果,从而为进一步在整体动物脊髓水平研究VGLUT2的功能提供有力的工具.方法:首先分别将已筛选到的两对互补并靶向作用于编码大鼠VGLUT2序列两个位点的特异性shRNA序列和一个阴性对照的寡核苷酸,克隆到pGCSIL-GFP质粒(经Age(Ⅰ)和EcoRI双酶切)载体内,经酶切、测序鉴定及转染293T细胞,包装得到病毒颗粒.然后将筛选出的慢病毒感染体外分离、培养的胚胎大鼠脊髓神经元,将培养的原代神经元分为正常组、阴性对照组、VGLUT2-shRNA-1组和VGLUT2-shRNA-2组,在荧光显微镜下分别观察GFP的表达情况；同时运用Westernt blot检测各组VGLUT2蛋白的表达水平.结果:免疫荧光检测显示,阴性对照组、VGLUT2-shRNA-1组和VGLUT2-shRNA-2组脊髓原代培养神经元均能观察到明显的GFP荧光,表明这些神经元已被慢病毒载体高效转染；但VGLUT2 shRNA-1组和VGLUT2 shRNA-2组神经元VGLUT2的表达量明显低于正常组和阴性对照组.Western blot结果显示,VGLUT2-shRNA-1组和VGLUT2-shRNA-2组的VGLUT2蛋白的表达量与正常组和阴性对照组相比明显有所下降,分别占正常组的62.42±1.12％和66.07±1.33％ (P ＜0.05),但VGLUT2-shRNA-1组和VGLUT2-shRNA-2组之间无显著性差异(P＞0.05)；阴性对照组与正常组相比亦无明显差异(P＞ 0.05).结论:VGLUT2-shRNA-1组和VGLUT2-shRNA-2组重组慢病毒载体均能有效地感染原代培养脊髓神经元,并高效下调其神经元内目的基因VGLUT2的表达.
