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H-Ras12V克隆文献资料
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人H-Ras12V突变蛋白表达载体的构建及表达
目的:构建研究H-Ras12V突变蛋白的表达载体,并在体外进行表达和榆测.方法:从细胞中分离提取RNA,通过RT-PCR扩增获得人的正常H-Ras cDNA,测序鉴定.通过PCR介导的定向突变的方法,在其第12位氨基酸处引入一个错义突变G→V,连入测序载体进行鉴定.应用DNA重组技术,将获得的H-Ras12V cDNA插人真核表达载体pEGFPc2,使用限制性酶切反应鉴定.通过脂质体将重组质粒转染入Hela细胞,使用Western Blot对其融合蛋白进行检测.结果:经过Xho I和BamH I的双酶切以及测序鉴定证实成功构建了 pEGFP-H-Ras12V融合蛋白表达载体,克隆基因与GenBank登陆结果一致并成功实现其第12位氨基酸G→v的突变.Western Blot 证实融合蛋白特异性表达,并在转染的细胞系中观察到绿色荧光蛋白的表达.结论:成功构建了pEGFP-H-Ras12V融合蛋白的表达载体,并在体外鉴定EGFP-HRasl2V融合蛋白的表达.
关键词： H-Ras12V克隆 表达载体 融合蛋白
