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MINT蛋白(1～365氨基酸)与Vav1相互作用及其位点的验证
目的: 明确MINT(Msx2-interacting nuclear target protein) N-末端与Vav1之间的相互作用,进一步探讨MINT的转录抑制调控功能及其机制.方法: 以克隆有MINT-F1片段(1～365氨基酸)的pGBKT7-F1质粒作为诱饵,分别与pACT2-V23#,pGADT7-V620,pACT2-V8900,pGADT7-SH2和pGADT7-SH3几个克隆有Vav1不同结构域的质粒,用酵母双杂交方法分析它们之间的相互作用.结果: pACT2-V23#与pGBKT7-F1之间、pACT2-V8900与pGBKT7-F1之间有比较明确的相互作用,而pACT2-V23#与pGBKT7-F2～F6、pGBKT7-F1与pGADT7-V620、pGADT7-SH2和pGADT7-SH3之间均无相互作用.结论: ① MINT N-端的F1段与Vav1发生相互作用;② Vav1与MINT的F1段发生相互作用的区域位于其SH2-SH3-C端结构域,而且独立的Vav1 SH2或SH3-C端结构域均不能发挥与MINT的F1段产生相互作用的功能.
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核基质MINT C端片段(2226-2959)相互作用分子的筛选与鉴定
目的:为了研究MINT的功能及其转录抑制的机制,筛选与MINT相互作用的蛋白.方法:以MINT第2226-2959氨基酸(F5为诱饵,用酵母双杂交法筛选小鼠胚胎9 d的cDNA文库.用诱饵质粒和文库先后转化酵母宿主后,对4.5×106个酵母克隆进行了营养筛选和α-半乳糖苷酶筛选,获得51个阳性克隆.从中提取质粒进行酶切鉴定,获得10个非重复克隆,对此10个克隆进行序列分析.结果:筛选到的3个基因分别为MINT,α-晶状体蛋白结合蛋白1(A1phaA-CRYBP1)和核受体辅抑制因子1(N-CoR1).在酵母中分析了N-CoR1与MINT的作用区段,N-CoR1与MINT的2226-2959和2960-3576两个片段均有相互作用.结论:①MINT在细胞内可能形成二聚或多聚体;②除了RBP-J和MSX2外,MINT还可能调节AlphaA-CRYBP1的活性;③MINT可能通过N-CoR1募集组蛋白去乙酰化酶(HDAC)进行转录抑制.
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MINT蛋白(1-365氨基酸)相互作用分子的筛选
目的: 用酵母双杂交技术筛选与MINT(Msx2-interacting nuclear target protein)-F1片段相互作用的分子,对MINT转录抑制的机制进行探讨. 方法: 以Mint-F1片段(1～365氨基酸残基)连入载体pGBKT7构建的质粒为诱饵,利用酵母双杂交技术对人淋巴结cDNA文库进行筛选,并分析所获得的阳性克隆. 结果: 从6×107 个克隆中共获得12个不重复的阳性克隆. 经序列分析,得到3个有意义的基因,分别为人小核RNA-蛋白复合体多肽G(SNRPG)、癌基因Vav和人微球蛋白1 (MCRS1). 结论: 从筛选到的这3个分子的定位与功能来看,MINT分子的N端片段可以与小核RNA-蛋白复合体(snRNPs), Vav, MCRS1和RBP-Jκ等相互作用,参与细胞内的信号传递,调控细胞周期,并可能影响RNA的加工与处理.
关键词： MINT 小核RNA-蛋白复合体多肽G 癌基因Vav 微球蛋白1 酵母双杂交
