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Q61R和V112A突变的HRAS基因在NIH小鼠体内诱发肿瘤的实验研究
目的:分析含有HRAS(V112A)基因及其G12C、G13C、Q61R和G12C/G13C/Q61R突变体的质粒DNA在NIH小鼠体内的致癌性.方法:从人结肠癌DiFi细胞中扩增含有V112A突变的HRAS(V112A)基因,采用PCR点突变法在HRAS(V112A)中分别引入G12C[HRAS(V112A/G12C)]、G13C[HRAS(V112A/G13C)]、Q61 R[HRAS(V112A/Q61R)]或3位点联合突变[HRAS(112A/G12 C/G13C/Q61R)],将HRAS(V112A)及上述突变基因克隆入真核表达载体pCDNA3.1(+),Western blot确证HRAS(V112A)及各突变体可体外表达后,每种质粒按每只100 μg剂量皮内注射6～8周龄雌性NIH小鼠,阴性对照组注射PBS,每组8只小鼠,持续观察小鼠致瘤情况.注射后4个月,取小鼠瘤样组织分别采用PCR和Western blot方法检测病变组织中的HRAS基因及其表达产物.结果:从DiFi细胞中成功扩增出含有V112A突变的HRAS(V112A)基因,并构建4个突变体,体外转染结果表明各HRAS均可在L929细胞中表达.重组质粒注射小鼠后,HRAS(V112A)组有4只小鼠注射后4个月于注射部位出现增生样改变,该病变在1个月后自愈;HRAS(V112A/Q61R)组有1只小鼠于注射后4个月出现明显的瘤样增生.至观察期末,HRAS(V112A/G12C)、HRAS(V112A/G13C)和HRAS(V112A/G12C/G13C/Q61R)组小鼠均未出现可见增生样结节.病变组织的PCR和Western blot检测结果表明HRAS(V112A)组小鼠增生样组织和HRAS(V112A/Q61R)组小鼠肿瘤组织中均有对应的HRAS基因存在和表达.结论:HRAS(V112A)可在NIH小鼠体内导致注射部位皮肤的增生样改变,含有Q61R突变的HRAS(V112A)可在NIH小鼠体内诱导肿瘤形成,含有G12C、G13C及G12C/G 13C/Q61R突变的HRAS(V112A)在小鼠体内不会引起明显病变.
