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功能基因研究文献资料
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冬凌草IrCYP71基因的克隆和功能
目的:克隆冬凌草二萜类化合物生物合成途径下游关键酶基因IrCYP71,进行序列特征分析,对此基因编码的蛋白进行原核表达分析以及亚细胞定位,并对蛋白在宿主细胞表达的条件进行了优化.方法:根据转录组测序所得的IrCYP71基因片段,克隆出全长cDNA序列;构建pET28a(+)-IrCYP71重组质粒,转化到Rosetta感受态细胞,小量表达和大量表达蛋白并鉴定,进行包涵体蛋白的纯化与复性,再对复性蛋白纯化鉴定分析.基于gateway克隆技术构建出PCR8/GW/TOPO-IrCYP71载体之后与改造Pearleygate104载体重组,之后与农杆菌GV3101重组,转入烟草中瞬时表达,从而进行蛋白亚细胞定位.结果:克隆得到的IrCYP71基因全长cDNA为1 593 bp,编码530个氨基酸,并在GenBank注册(登录号MG800628).经大肠埃希菌表达系统表达的重组蛋白相对分子质量正确,在62 kDa左右,纯化后的重组蛋白总量有1 mg,蛋白纯度为85％.此蛋白亚细胞定位在细胞核.结论:对冬凌草IrCYP71基因进行了初步验证,并对基因表达的蛋白进行原核表达和亚细胞定位,使该基因在冬凌草二萜成分的生物合成过程中的作用得到了进一步的阐述.
