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刺五加P450基因原核表达体系的建立与表达条件的优化
根据已克隆得到的刺五加P450基因的cDNA序列设计引物,构建刺五加P450基因的原核表达载体pET30a-P450,并对重组菌株BL21/pET30a-P450的原核表达条件进行了筛选优化.实验结果显示,pET30a-P450转化大肠杆菌BL21后可实现P450基因的原核表达,SDS-PAGE分析显示其在53 kDa处有显著诱导条带;表达体系的佳诱导温度为27～37℃,佳IPTG浓度为1 mmol·L-1,佳培养基为LB液体培养基,佳诱导时间为24h.因此,刺五加P450基因能够通过表达载体BL21/pET30a-P450实现该基因的原核表达,该体系的诱导温度、IPTG浓度、培养基种类以及诱导时间均可影响目的蛋白的表达量,但影响强度不同.
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重组人亲环蛋白CypB的制备及活性鉴定
目的·构建人源亲环蛋白B (hCypB)的表达载体,通过原核表达体系制备有活性的hCypB.方法·通过双酶切法将编码hCypB基因构建到pGEX-6p-1表达载体中,采用亲和层析法一步纯化hCypB,后通过GST-pulldown验证过表达的hCypB的活性.结果·经DNA测序验证,成功构建了hCypB的表达质粒.通过GST柱纯化可以从1L过夜诱导的大肠埃希菌菌液中获得26 mg,纯度达到90％的GST-hCypB融合蛋白,且GST-pulldown试验证明该重组蛋白可以与脯氨酸-3-羟化酶1(P3H1)及软骨相关蛋白(CRTAP)形成三元复合物.结论·利用该实验方法可以在短期内获得大量高纯度、有活性的人源亲环蛋白CypB.
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大肠杆菌非偏爱密码子的数量及位置对外源蛋白表达的影响
目的:研究大肠杆菌非偏爱密码子GGG在目的蛋白中的数量及位置对原核表达体系的影响.方法:以内皮抑素为研究对象,利用Overlapping-PCR定点突变内皮抑素中部密码子为GGG,构建到载体pET28a中,研究内皮抑素表达水平.结果:一个GGG密码子存在并不会降低或者阻止内皮抑素的表达,两个GGG存在并且距离很近时可显著降低内皮抑素的表达,当3个GGG串联存在时可阻止内皮抑素的表达.结论:GGG数量以及位置的不同可对外源目的蛋白的表达水平造成显著影响.
关键词： 大肠杆菌非偏爱密码子 内皮抑素 原核表达体系
