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猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4-F112弱毒株NSP2区表达猪瘟病毒E2基因表位的研究
建立共表达猪瘟病毒(Classic swine fever virus,CSFV) E2蛋白主要中和性抗原表位基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)反向遗传操作平台,为进一步研究PRRSV作为病毒载体提供实验数据.本研究在PRRSVHuN4-F112疫苗株感染性分子克隆的基础上,采用突变PCR技术将CSFV E2蛋白的主要中和性抗原表位基因插入HuN4-F112弱毒株PRRSV已鉴定出的两个NSP2蛋白的复制非必需区,经基因片段的克隆、拼接,构建了两株含有CSFV E2蛋白的主要中和性抗原表位基因的感染性PRRSV cDNA克隆psk-HuN4-F112-Δ508-532+ E2和psk-HuN4-F112-Δ480-532+ E2.用限制性内切酶Swa Ⅰ分别将两株共表达的感染性克隆线性化,之后通过细胞外转录获得病毒RNA,用脂质体法分别将病毒RNA转染BHK-21细胞包装出病毒粒子,再分别将其转接到MARC-145细胞传代拯救出两株病毒.分别对两株拯救病毒进行RT-PCR扩增、酶切和序列分析鉴定.结果表明,两株拯救病毒含有不同于亲本病毒的分子标记(拯救病毒基因组的14 667位因同义突变产生的MluⅠ酶切位点)和插入基因序列.间接免疫荧光试验表明,CSFV E2蛋白主要中和性抗原表位基因均能在两株拯救的PRRSV中表达,且能够在其传代过程中稳定遗传.病毒生长特性结果比较显示两株拯救病毒与亲本病毒在MARC-145细胞上具有相似的增殖特性.本研究构建了两株共表达CSFV E2蛋白主要中和性抗原表位基因的PRRSV感染性克隆并获得了拯救病毒,且外源基因能在拯救病毒中稳定表达,为进一步开发新型PRRSV二联疫苗提供了有效的反向遗传操作平台.
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 感染性cDNA 拯救病毒 病毒载体
