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去除致癌基因的EB病毒潜伏膜蛋白1的重组腺病毒的构建及其免疫效果
为进一步研究利用EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)进行免疫治疗的可行性,构建了含有去除致癌基因的EB病毒LMP1片段(LMP1△)的穿梭质粒pAdTrack-CMV-LMP1△,将它与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1用电转染的方法共同导入大肠杆菌BJ5183中,在宿主菌重组酶的介导下进行同源重组.通过抗性筛选,获得含有重组腺病毒基因的质粒;然后再通过脂质体将重组腺病毒质粒导入腺病毒包装细胞HEK293细胞中,在HEK293细胞E1蛋白的反式作用下,病毒被包装.将包装病毒的细胞裂解上清进行PCR鉴定证实,病毒DNA中含有目的基因的特异性片段.RT-PCR证明了外源基因在真核细胞中得以转录,免疫酶和Western blot的结果也显示,LMP1△蛋白在真核细胞得到表达.将扩增后的病毒感染HeLa细胞,测定病毒滴度为3.0×109PFU/ml.为初步探讨其免疫效果,采用肌肉注射和滴鼻的方式感染Balb/c纯系小鼠,免疫酶检测其特异性抗体,LDH法检测特异性CTL的杀伤作用,结果发现,两种免疫途径均可诱发小鼠针对LMP1的特异性体液免疫和细胞免疫,而且Ad5作为免疫对照组的小鼠则没有引起相应的免疫反应.
关键词： EB病毒 重组腺病毒 EB病毒潜伏膜蛋白1△ 特异性细胞毒作用 -
EB病毒潜伏膜蛋白2 DNA疫苗的构建及其初步免疫效果观察
目的以EB病毒潜伏膜蛋白2(latent membrane protein 2,LMP2)为靶基因,构建EBV-LMP2的侯选DNA疫苗;并初步探讨其在小鼠体内诱导特异性细胞毒方面的作用,为研制鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)等EB病毒相关肿瘤的治疗性疫苗提供有益资料.方法将EB病毒LMP2全cDNA片段克隆至含CMV早期启动子的真核表达载体pcDNAⅢ上,构建CMV启动子EB病毒LMP2 DNA疫苗.在体外将重组质粒转染COS细胞,以RT-PCR和间接免疫荧光法检测重组质粒在转染的COS细胞中的转录和表达.采用50μg、100μg、200μg 3种质粒剂量进行初步的小鼠免疫试验.结果重组质粒可在真核细胞中有效地转录和表达LMP2.免疫接种小鼠后可诱发机体产生针对LMP2蛋白的特异性体液免疫和细胞免疫.50μg、100μg、200μg 3种免疫剂量产生的抗体水平差异不大.在免疫接种6周后,重组质粒免疫的小鼠产生针对LMP2的特异性CTL均明显高于空载体免疫小鼠.3种剂量的CTL结果显示:在100μg、200μg免疫组,小鼠诱导产生的CTL水平要略高于50μg免疫组.结论 EB病毒重组质粒LMP2 免疫小鼠可以诱发小鼠产生特异的体液和细胞免疫应答.这些结果为研制鼻咽癌DNA疫苗提供有益的资料.
