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牛泡沫病毒调节蛋白功能及其在LTR上应答元件的研究
牛泡沫病毒(BFV)具有复杂的基因组结构,其基因组除编码反转录病毒共有的gag、pol、env三个结构基因之外,在其env和3′LTR之间有两个重叠的读码框(ORF-1和ORF-2),编码Borf-1、Borf-2、Bet等多种调节蛋白,其中Borf-1(249aa)为BFV反式激活因子(Tas).为研究Borf-1的结构与功能,Borf-1在LTR上的应答元件及作用机制,Borf-2、Bet等调节蛋白在BFV基因表达调控中的作用,本研究以本室分离鉴定的BFV3026中国毒株为材料,克隆Borf-1等基因片段构建系列质粒,与带有luc报告基因的LTR系列缺失质粒共转染,作瞬时表达分析.结果表明,Borf-1 37aa～114aa、C端218aa～249aa为其行使激活功能所必需区域;Tas在BFV LTR上的应答元件(TRE)位于-983/-668(TREI)、-470/-140(TREII)和RU5区,其中TREI、TREII均位于U3区,为正调控元件,RU5区为负调控元件.进一步研究证明,TREII能在异源启动子(BIV LTR)上行使功能,且与其自身的方向无关,类似于增强子元件.此外还发现,RU5区具有抑制其下游基因表达的功能,该区在异源启动子(BIV LTR)之后使其下游基因表达量降低.计算机分析结果表明,BFV RU5区的负调控作用可能是因为该区mRNA具有稳定的二级结构,从而抑制其下游基因的表达(转录或转录后水平调控);Borf-2在体外实验中不参与BFV LTR起始的基因表达;Bet等对Borf-1的激活功能具有反式显性抑制作用(trans-dominant inhibitory effect).这些结果表明:BFV Tas作用机理与慢病毒Tat和致瘤病毒Tax均不相同.
