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沉默Smo基因对大鼠原代软骨细胞增殖与凋亡的影响
目的：观察沉默Smo基因后对大鼠原代软骨细胞增殖与凋亡的影响。方法用机械-酶消化法获取原代大鼠软骨细胞，经免疫细胞化学Ⅱ型胶原（ ColⅡ）鉴定后，将实验分为对照组、control siRNA组和Smo siRNA 1～3组，以慢病毒为载体将siRNA转入软骨细胞，72 h后，MTT法检测细胞活力；反转录PCR （ RT-PCR）及蛋白印迹（ Western blot）检测Smo的表达量；流式细胞术检测细胞凋亡率。结果各组序列经慢病毒载体成功转染到原代软骨细胞中， Smo siRNA1～3均不同程度的抑制Smo的表达，以Smo siRNA2组为明显，其mRNA及蛋白的表达分别为0.19±0.03和0.39±0.07；同时，Smo siRNA2组细胞活力低（77.38％±7.19％）而凋亡率高（21.43％±2.97％）。结论沉默Smo可抑制原代软骨细胞增殖，并诱导软骨细胞凋亡，Smo具有保护软骨细胞免遭凋亡的作用。
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电穿孔法介导 siRNA 高效转染小鼠原代软骨细胞
目的：建立小鼠原代软骨细胞高效电转siRNA的方法。方法常规分离得到的小鼠原代软骨细胞继续用链丝菌蛋白酶消化3h，然后应用高效电转缓冲液和优化的电转参数转染pCMV－EGFP表达质粒或siRNA，用台盼蓝检测细胞存活率；转染后48h分析转染效率和siRNA靶分子的mRNA和蛋白表达水平。结果电穿孔后原代软骨细胞的存活率＞80％，质粒的转染效率达到37．3％±5．2％；siRNA靶分子的mRNA和蛋白表达水平分别下调了75％和66％。结论成功建立了通过电穿孔介导siRNA转染小鼠原代软骨细胞的方法，达到了很好的基因沉默效果且保持了较高的细胞存活率。
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Hh信号通路在氟致大鼠原代软骨细胞损伤中作用
目的 探讨体外染氟软骨细胞中刺猥蛋白基因(Hh)信号通路中音速刺猬蛋白、跨膜蛋白(Smo)及下游骨形态发生蛋白-2(BMP-2)因子表达在氟中毒软骨细胞损伤中的作用.方法 取1周龄健康SD大鼠,用机械、酶消化法分离膝关节软骨细胞,免疫细胞化学对原代软骨细胞进行鉴定.实验设对照组和染氟组(5、10、20、40 mg/L).培养48 h后,噻唑蓝法检测各组细胞活力,蛋白印迹及逆转录PCR分别检测各组细胞Smo、Shh、BMP-2蛋白及mRNA表达;流式细胞术检测各组细胞凋亡情况.结果 与对照组比较,5、10 mg/L染氟组细胞活力[分别为(113.33±11.74)％、(127.25±10.24)％]明显升高,40 mg/L染氟组细胞活力[(73.91±9.94)％]明显下降(P＜0.05);染氟组细胞中Shh、Smo、BMP-2蛋白和mRNA的表达量随染氟浓度增加而升高;40 mg/L染氟组细胞凋亡率为(11.13±1.20)％,明显高于对照组.结论 氟可激活软骨细胞中Hh信号通路,Hh信号通路与软骨细胞凋亡可能共同参与氟中毒软骨损害过程.
关键词： 原代软骨细胞 NaF 刺猬蛋白基因(Hh) 凋亡 -
慢病毒及脂质体法转染原代软骨细胞的实验研究
目的：利用慢病毒载体及Lipofectamine2000脂质体转染大鼠原代软骨细胞，探讨转染软骨细胞的理想条件。方法采用机械—酶消化法获取原代软骨细胞，经Ⅱ型胶原（ColⅡ）鉴定后，使用慢病毒载体介导GFP及利用Lipofectamine2000介导的FAM‐siRNA分别转染原代软骨细胞，倒置荧光显微镜检测转染效率，MTT法测定原代软骨的增殖活力，流式细胞术检测细胞凋亡率。结果采用脂质法转染软骨细胞不理想，转染率不到10％。运用慢病毒载体后转染率明显高于脂质体法，且随感染复数（病毒滴度×病毒液体积／细胞数，MOI）增加而增加，MOI为100时，转染率可达92．85％。MTT及流式结果显示，低MOI时，软骨细胞活力及凋亡率与对照组相比差异无统计学意义；当高MOI（200）时，细胞活力[（81．32±10．72）％]明显低于对照组，而细胞凋亡率[（21．37±2．80）％]明显高于对照组。结论当MOI为100时可作为转染软骨细胞安全有效的条件，这为细胞转染技术在软骨细胞的研究领域提供实验基础。
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不同氟浓度对大鼠原代软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响
目的：观察不同氟浓度对大鼠原代软骨细胞Ⅱ型胶原（ColⅡ）表达的影响，探明ColⅡ在染氟软骨细胞的表达意义。方法取1周龄健康SD大鼠，用机械‐酶消化法分离膝关节软骨细胞，经甲苯胺蓝鉴定后，取第三代细胞将实验分为对照组和染氟组（5mg／L、10mg／L、20mg／L、40mg／L）五组，培养3d后，经MTT检测各组细胞活力，并采用Westernblot、免疫组化检测各组细胞ColⅡ蛋白表达。结果NaF培养3d后，细胞活力在5mg／L、10mg／L组较正常组高，在40mg／L组较正常组低，ColⅡ蛋白的表达在10mg／L组较正常组高，在40mg／L组较正常组低，差异有有统计学意义（P＜0．05）。结论低浓度的氟对大鼠原代软骨细胞具有促进增殖作用，而高浓度具有抑制增殖作用，其机制可能与ColⅡ的分泌有关。
