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干细胞标记及示踪技术的应用研究
在基础研究及临床应用中,对干细胞迁徙路径的标记及在靶病灶的作用研究已成为重点.采用创新性、突破性的干细胞标记及示踪技术,了解于细胞在机体内的迁徙途径,监测和追踪干细胞移植治疗后的效果,对其在动物实验和临床应用方面都起到良好的促进作用.
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心脏成纤维细胞生物表型多样性
目的 探讨心脏成纤维细胞(CFs) 生物表型多样性.方法 新生1～3天SD大鼠12只,胰蛋白酶/胶原酶联合消化法分离培养新60只生大鼠CFs,比较原代和传代培养细胞形态学变化,免疫组织化学学检测鉴定常见成纤维细胞标记波形蛋白(vimentin) 、成纤维细胞特异性蛋白1(FSP1) 和盘状结构域受体(DDR2) 的表达,细胞免疫荧光检测CFs干细胞标记nanog、c-kit、sca-1、CD73和CD90的表达,细胞免疫荧光三标技术检测CFs干细胞标记间的共表达情况.结果 酶联合消化法分离培养的CFs收获细胞量大,第3代细胞活力好、纯度高. Vimentin、FSP1和DDR2在CFs中均表达,但DDR2在CFs中呈强表达.部分CFs分别表达nanog、c-kit、sca-1、CD73和CD90,部分nanog阳性的CFs分别和CD73、CD90和sca-1,及其CD90和sca-1存在共表达,nanog + /CD73 + 共表达阳性率高(59. 02％ ± 8. 39％) ,与其他3组相比差异均有极显著性(P＜0.01);而nanog + /CD90 + 共表达阳性率与nanog + /sca-1 + 之间差异无显著性(P＞0.05) ,但这两组与CD90 + /sca-1 + 相比差异均有极显著性(P＜0.01);CD90 + /sca-1 + 共表达阳性率均低于其他3组,差异具有极显著意义(P＜0.01).结论 CFs是具有干细胞特征混合细胞群,在表型上具有多样性.
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人肝癌CD133+细胞亚群的分离及致瘤性
目的 从人肝癌组织中分离CD133+细胞亚群并探讨其致瘤能力.方法 将人肝癌组织种植于裸鼠皮下形成移植瘤,将移植瘤标本消化制成单细胞悬液.流式细胞仪检测CD133+的表达.免疫磁珠分选法进一步分离纯化CD133+细胞.免疫荧光检测CD133+细胞亚群的组织表型.对不同亚群细胞进行体外克隆形成实验和裸鼠体内移植瘤形成实验.结果 流式细胞仪检测显示,肝癌组织中(4.1±0.6)％的细胞为CD133+细胞.免疫荧光显示分离纯化的细胞中,CD133+细胞占(86.8±7.5)％.体外培养显示CD133+亚群比CD133-亚群具有更强的克隆球形成能力,在裸鼠体内具有更强的肿瘤形成能力(P＜0.05).结论 从人肝癌组织中分离的CD133+细胞亚群具有高致瘤性,可能为肝癌干细胞.
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BrdU 标记家兔脂肪组织来源干细胞的体外研究
目的 通过采用 BrdU 标记连续培养的家兔脂肪组织来源干细胞(adipose-derived stromal stem cells,ADSCs),检测其佳标记时间、标记剂量及毒性作用,探讨其作为干细胞标记示踪方法的可行性. 方法 8～12 周龄健康新西兰大白兔 6 只,雌雄不限,体重 1.5～2.0 kg.切取腹股沟皮下 1～2 mL 脂肪组织,采用贴壁法体外分离培养ADSCs,并进行鉴定.取第 3 代细胞以终浓度分别为5、10、15 和 20 μg/mL 的 BrdU 进行标记,分别记为A、B、C及 D 组;另 1 孔不含 BrdU,作为空白对照(E 组).标记12、24、48 和 72h后,采用免疫组织化学检测各组细胞阳性率,苔盼蓝排染法行细胞计数观察标记后细胞活性. 结果 原代培养的ADSCs形态主要为宽大、扁平、短梭形细胞;传代后细胞形态主要为长梭形;第3代 ADSCs经诱导均能向成骨细胞和脂肪细胞分化.免疫组织化学观察:第3代 ADSCs 经 BrdU 标记后,在荧光显微镜下胞核呈绿色荧光.孵育 12h,A、B、C、D 组细胞标记阳性率逐渐增高,分别为 30.6%±2.3%、32.4%±1.9%、45.8%±1.8%、50.8%±3.1%,C、D组与 A 组比较,差异有统计学意义(P<0.01);24 h,A、B、C及D组标记率分别为45.9%±2.0%、87.9%±3.3%、90.6%±2.9% 及 91.7%±3.2%;48 h 和 72 h,A、B、C、D 组标记情况与24 h 相似;E 组各时间点细胞标记阳性率为 0.孵育 24、48及72 h,B、C及D组细胞阳性率与 A 组比较,差异均有统计学意义(P<0.01).孵育12、24、48 及 72 h细胞计数,各组细胞活性均在90%以上,A、B、C、D组与E组比较,差异无统计学意义(P>0.05). 结论 BrdU 标记 ADSCs 的佳时间为 48 h,佳浓度为 10μg/mL;BrdU 对细胞标记率及安全性高.
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EdU体外标记人脂肪干细胞的实验研究
目的:体外培养人脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)-并-行EdU标记,并通过测试标记率及标记后对细胞增殖分化的影响确定优化的标记时间及浓度组合.方法:使用分别采5μM,10μM,20μM,50μM的浓度及12h,24h进行标记标记ADSC,并以流式细胞仪精确测定标记率.挑选出各12h及24h时优化标记浓度,并进行标记后测定细胞活性,增殖及诱导分化实验.结果:P3代细胞约90％以上表达表面标记CD90+,CD105+,CD44+.基本不表达细胞表面标记CD45+,CD35+.通过各试验,得出适浓度组合10μM,12h,对进一步研究脂肪干细胞在辅助脂肪移植中的作用具有指导意义.结论:EdU是标记方法简单有效,体外佳标记浓度组合是10μM,12h.
