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小分子干扰RNA(siRNA)表达载体沉默靶基因的研究
目的研究siRNA表达载体在体外培养细胞中对目的基因的干扰作用,建立利用RNA干扰技术研究基因功能的平台.方法构建针对β-actin基因的表达siRNA载体,转染HeLa细胞,然后在mRNA水平、蛋白水平和细胞形态水平评价siRNA表达载体对β-actin基因表达的抑制作用.结果siRNA表达载体可以有效的抑制体外培养细胞β-actin基因的表达,使β-actin基因的mRNA和蛋白表达量显著下降,细胞形态发生显著变化.结论siRNA表达载体可以在体外培养细胞中有效的沉默β-actin基因,为研究基因功能提供了一个快速、有效的系统.
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应用微滴式数字PCR定量检测结直肠癌患者血浆循环游离DNA
目的 建立基于微滴式数字PCR(ddPCR)技术定量检测结直肠癌(CRC)患者血浆循环游离DNA(cfDNA)含量的方法,并初步探讨其临床应用.方法 设计β-actin基因ddPCR特异性引物和探针,通过条件优化建立cfDNA定量检测方法;用不同浓度标准品验证所建方法的特异性、灵敏度、线性及重复性;并用该法检测39例CRC患者与40例健康人群血浆标本,比较CRC患者与对照组、术前与术后组血浆cfDNA浓度差异.结果 所建方法无非特异性扩增,检测灵敏度为0.29 copies/μl,在模板浓度为10 pg/μl～ 10 ng/μl内线性良好(y=-2.34 +33.17x,r2=0.999),批内CV为9.85％,批间CV为11.04％;CRC患者血浆cfDNA结果(7.20 ±5.15) copies/μl明显高于对照组(3.38±1.97)copies/μl(P＜0.01);术后组血浆cfDNA浓度为(3.90±3.39) copies/μl,较术前组明显下降(P＜0.01).结论 建立的ddPCR定量检测血浆cfDNA方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可为CRC患者的临床决策和病程监控提供一种无创手段.
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CYP4F2和β-actin基因实时荧光定量PCR标准品质粒和标准曲线的构建
目的 制备用于CYP4 F2和β-actin基因mRNA实时荧光定量PCR检测的标准品质粒与标准曲线.方法 通过PCR扩增CYP4F2和β-actin进行双酶切鉴定和测序分析,确保重组质粒完整正确;大量抽提重组质粒,测定其拷贝浓度,10倍稀释成梯度标准品,目的片断纯化后直接连接于pGEM-T easy载体,转化Ecoli DH5α宿主菌,获得阳性克隆;通过PCR扩增进行荧光定量PCR检测分析.结果 CYP4 F2和β-actin基因目的片段均成功重组,获得的重组质粒保持了目的片段的特异性和序列完整性.梯度浓度标准质粒的实时荧光定量PCR结果显示,循环阈值(Ct)与起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系.结论 成功构建了CYP4 F2和β-actin基因实时荧光定量PCR标准品质粒和标准曲线.
