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双特异性启动子调控条件复制腺病毒载体的构建
目的 构建并鉴定既能在人端粒酶反转录酶(hTERT)启动子调控腺病毒早期区域1A(E1A)基因,又能在胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子引导入钠碘转染体(hNIS)基因的腺病毒载体.方法 采用免疫印迹分析检测人脑星形胶质母细胞瘤细胞U87、人神经胶质瘤细胞U251和人胚肺成纤维细胞MRC-5细胞感染病毒前自身GFAP和端粒酶蛋白的表达情况.通过PCR扩增获得hTERT启动子、GFAP启动子及hNIS基因,采用基因合成腺病毒E1A基因.采用hTERT和GFAP启动子重组质粒转染MRC-5、U251、U87细胞,转染24 h后应用荧光分析法检测hTERT启动子及GFAP启动子的启动活性.再将上述特异性启动子分别与E1A基因和hNIS基因连接,后插入穿梭质粒pDC311中,构建重组质粒pDC311-Tp-E1A-Gp-NIS,并应用EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ双酶切及测序鉴定.将pDC311-Tp-E1A-Gp-NIS与骨架腺病毒质粒pBHGlox△E1-3Cre共转染人胚肾293细胞,得到条件复制腺病毒Ad-Tp-E1A-Gp-NIS后,分别感染293、MRC-5、U87和U251细胞,利用病毒空斑形成实验检测条件复制腺病毒的复制能力.使用重组腺病毒Ad-Tp-E1A-Gp-NIS及Ad-CMV-EGFP(对照)感染U251、U87及MRC-5细胞后,采用γ计数器测定由hNIS基因介导的摄125I能力.结果 在U87和U251细胞中,均有相对分子质量120000的端粒酶和49000的GFAP蛋白的表达,在MRC-5中,则无表达.GFAP启动子和hTERT启动子能引导目标基因胶质瘤靶向性表达,启动效率分别为U87细胞中(62.10±6.26)％和(49.24±1.73)％,U251细胞中(59.75±34.36)％和(37.31±16.86)％.限制性内切酶能将质粒pDC311-Tp-E1A-Gp-NIS酶切成3252、5500 bp的片段,经测序鉴定后与预计序列一致.成功构建的Ad-Tp-E1A-Gp-NIS条件复制腺病毒,在U87和U251细胞能很好的产生病毒颗粒,在293细胞也能实现复制,但是在MRC-5细胞中则无病毒产生.U251和U87细胞感染Ad-Tp-E1A-Gp-NIS后均具备了较明显的摄125I能力,约为对照组的93.4倍和107.1倍[(60 679.42±635.61)cpm/100 mg比(656.67±9.25) cpm/100 mg,(69 593.10±1842.89)cpm/100 mg比(660.63±16.01)cpm/100 mg,均P＜0.05].MRC-5细胞感染后与对照组比较则未见明显的125I摄取[(649.67± 13.66)cpm/100 mg比(649.67± 13.66) cpm/100 mg,P＞0.05].结论 构建的条件复制腺病毒Ad-Tp-E1A-Gp-NIS具有良好的条件复制能力,并可以摄125I介导放射性碘治疗.
