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库京病毒TaqMan荧光RT-PCR检测方法的建立
目的 库京病毒(Kunjin virus,KUNV)为黄病毒属病毒,是西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)的亚型.由于我国存在其流行的生态学条件,传入的风险很大.因此,亟待建立快速、灵敏、高效的TaqMan荧光RT-PCR方法用于国境口岸KUNV的监测,防止其传入. 方法 从GenBank 中检索KUNV全基因序列,通过MEGA 4软件进行序列比对和Blast进行保守序列搜索分析,选取E基因片段为模板.利用Beacon Designer 7.0软件针对模板设计引物和探针,进行TaqMan荧光RT-PCR检测并优化反应条件和引物浓度,退火温度设定为50、55、60℃,引物终浓度设定为200、400、800 nmol/L,探针终浓度设定为100、200、400 nmol/L,通过扩增曲线与Ct值分析确定佳退火温度、佳引物及探针终浓度并验证该方法的敏感性和特异性. 结果 通过分析比较,确定KUNV荧光RT-PCR检测方法佳退火温度为55℃,引物终浓度为400 nmol/L,探针终浓度为200 nmol /L.该方法检测KUNV核酸的敏感度达1.83×102 cop-ies/μl,且与正布尼亚病毒属拉克罗斯病毒(La Crosse virus,LACV)、雪靴野兔病毒(Snowshoe hare virus,SSHV),甲病毒属巴马哈森林病毒(Barmah Forest virus,BFV)、马雅罗病毒(Mayaro virus,MAYV),黄病毒属乙脑病毒(Japanese en-cephalitis virus,JEV)、黄热病毒(Yellow fever virus,YFV),东南亚十二节段RNA病毒属版纳病毒(Banna virus,BAV)均无交叉反应. 结论 建立的TaqMan荧光RT PCR方法灵敏度高、特异性好,适合于KUNV的快速检测,具有应用价值.
关键词： 库京病毒 TaqMan荧光RT-PCR 检测 方法
