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高效检测人降钙素原化学发光免疫分析方法的建立与评价
目的 重组原核表达人降钙素原(PCT)蛋白,制备抗人PCT单克隆抗体,建立高效检测PCT化学发光免疫分析方法. 方法 根据NCBI提供的PCT基因序列,按照大肠埃希菌偏爱密码子优化后进行全基因合成,通过BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切将其构建到pET32a载体上;将pET32a PCT质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3),用异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,采用Western blot法分析重组蛋白表达情况;用镍亲和纯化柱纯化重组蛋白,以此为抗原免疫BALB/c小鼠.取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合,采用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,有限稀释法进行克隆化后再用间接ELISA法筛选阳性单克隆细胞;将阳性单克隆细胞接种于小鼠腹腔内,制备腹水单抗,经Protein A/G纯化后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,采用间接ELISA方法对抗体的特异性、灵敏度以及亲和力进行鉴定;用NaIO4氧化HRP法标记单克隆抗体,通过棋盘法筛选配对单克隆抗体,以筛选的配对抗体为捕捉抗体,建立双抗夹心化学发光免疫分析的血清学检测体系,检测临床150例血清标本,其中PCT升高(＞0.05 ng/ml) 120例,PCT阴性(＜0.05 ng/ml)30例. 结果 共筛选出6株抗人PCT蛋白的单克隆细胞,制备的腹水效价均大于4×10-6;通过棋盘法筛选得到2对能够进行双抗夹心配对的单抗,其中1对亲和力较高,其亲和力常数分别为2.39×108 L/mol和2.91×108 L/mol.双抗夹心化学发光免疫分析方法检测线性范围为0.06～8 ng/ml,其中阳性检出率为96.6％,阴性符合率为100％,与临床检测数据相比,相关系数R2=0.9737. 结论 建立的双抗夹心ELISA方法灵敏度高、特异性强、稳定可靠,可用于细菌、寄生虫等病原体感染患者的PCT血清学定量检测.
关键词： 单克隆抗体 人降钙素原(PCT) 双抗体夹心 定量检测
