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人ID4基因表达调控启动子及其亚克隆荧光素酶报道重组子的构建
本研究旨在克隆ID4基因启动子及上游调控序列,并构建一系列启动子亚克隆-pGL3 Basic荧光素酶报道重组子,以探讨ID4基因表达调控机制.方法与结果:以ID4基因cDNA全长作为探针,在NCBI的人类基因组数据库中搜索并下载ID4基因转录起始位点上游5'侧翼区约2242 bp及下游5'非翻译区212 bp的基因组序列;利用TESS和Genomax等在线启动子分析软件进行启动子及上游调控元件的特征分析,据此设计PCR引物,采用分段扩增法,获得了2条长度分别为1 829 bp和784 bp的产物片段,分别插入pGEM-T载体,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落;继之先后应用KpnI/NheI、KpnVEcom对获得的2个pCEMT重组载体及pGL3 Basic荧光素酶报道重组载体进行双酶切,用T4 DNA连接酶连接,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性茼落,成功构建了人ID4基因启动子-pGL3 Basic荧光素酶报道重组子;经Kpnl/NheI双酶切和测序鉴定,获得了与GenBank相应序列一致、长度为2 459 bp的目的片段;以此片段为模板,相隔400 bp左右设计了5对3'端平齐、5'端不同的PCR引物,进行半巢式PCR扩增,获得5条长度分别为2 112 bp、1 703 bp、1 290 bp、784 bp和496 bp片段,回收纯化后分别插入pGEM-T栽体,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落;继之用KpnI/NheI对获得的5个pGEMT 重组载体及pet3 Basic荧光素酶报道载体双酶切,T4 DNA连接酶连接,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落,经KpnI/NheI双酶切和测序鉴定.结论:成功克隆了长度为2.5 kb的ID4基因启动子及上游表达调控序列,构建了一系列ID4启动子亚克隆-pCt3-Basic荧光素酶报道重组子.
