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潜在活性位点文献资料
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10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-β-O-乙酰转移酶迭代饱和突变与活性位点分析
目的 利用迭代饱和突变技术进一步提高 10-去乙酰巴卡亭 Ⅲ-10-β-O-乙酰转移酶双突变体 DBATG38R/F301V的活性;通过丙氨酸扫描确定 DBAT 活性中心的重要位点.方法 利用迭代饱和突变技术在现有双突变体DBATG38R/F301V的基础上对 Ser396进行半饱和突变,筛选对10-去乙酰紫杉醇(DT)催化活性提高的突变体;对获得的高活性突变体蛋白进行催化 DT 的适温度和适 pH 测定;在适 pH 条件下,将其分别用适反应温度和 0 ℃温育 6 h,考察该蛋白的热稳定性;采用生物信息学方法分析活性提高的分子机制.对 DBAT 底物结合区域尚未进行分析的几个氨基酸进行丙氨酸扫描研究,分析这些位点在DBAT 催化 10-DAB 和 DT 过程中的作用.结果 获得了三突变体 DBATG38R/F301V/S396I,其催化 DT 的活性为 DBATG38R/F301V的 1.6 倍,该蛋白催化 DT 的适条件为 37.5 ℃,pH 7.5;该蛋白在 37.5 ℃ 静置 6 h 后催化 DT 的活力为初始值的 30%,在 0 ℃ 静置 6 h 后为初始值的 70%;丙氨酸扫描结果显示,Asn45在 DBAT 催化10-DAB 和 DT 时都非常重要,而 Asn42、Glu350、Glu355和Lys389位点对催化 10-DAB 的影响更大.结论 将活性口袋内的亲水性氨基酸向疏水性氨基酸突变可能有利于 DBAT 对 DT 的催化,但氨基酸侧链的长度和空间构型也是影响催化活性的重要因素;发现 Asn45可能是一个潜在的 DBAT 催化或底物结合位点.
