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用杆状病毒系统表达戊型肝炎病毒全长结构基因的研究
目的获取含有戊型肝炎病毒(HEV)全长结构基因的重组杆状病毒,表达戊型肝炎病毒结构蛋白.方法将HEV全长结构基因(5 147～7 126 nt)插入杆状病毒表达载体pAcUW51,与线性化杆状病毒DNA(Baculo Gold DNA)共转染Sf9昆虫细胞,挑病毒斑进一步感染Sf9细胞,用SDS-PAGE,Western Blot及免疫荧光检测戊型肝炎病毒结构蛋白的表达及活性.结果 SDS-PAGE分析表明HEV结构基因在杆状病毒系统中高效表达,有相对分子质量约为73 000和63 000两种形式;Western Blot及免疫荧光检测证明表达产物可与HEV阳性血清特异反应,说明具有HEV特异抗原性.结论应用杆状病毒表达系统成功表达了HEV结构蛋白.
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重组截短型人角质细胞生长因子1在昆虫细胞中的表达
目的:探讨重组截短型人角质细胞生长因子1( rhKGF1D23)蛋白在昆虫细胞中表达的可行性,为rhKGF1D23蛋白的生产提供新的途径.方法:PCR法扩增昆虫偏爱密码子优化截短序列kgf1d23亚克隆到pFastbac载体.在辅助质粒的作用下,pF astBac-kgf1d23载体Tn7片段转座到Bacmid中mini-attTn7位点,得到穿梭载体Bacmid-kgf1d23,并通过脂质体法转染sf-9细胞得到杆状病毒P1.继续转染细胞扩增病毒并提高病毒滴度,蛋白表达分析从P3代病毒转染细胞开始,收集细胞超声裂解后进行纯化,MTT法检测纯化后目的蛋白生物活性.结果:昆虫偏好密码子改造的kgf1d23基因构建进转移载体pFastBac-kgf1d23和穿梭载体Bacmidkgf1d23载体中.SDS-PAGE结果表明,重组蛋白在60 h后开始大量表达,优化的收获蛋白时间在84～96 h；利用肝素亲和层析和SP阳离子交换层析可以去除90％以上的杂蛋白.纯化的rhKGF1D23蛋白在0.3～25.0 μg·L-1时,随浓度的增加HaCat细胞的促有丝分裂能力增强,在25.0 μg·L-1时达到平台期.结论:重组截短型角质细胞生长因子rhKGF1D23蛋白在昆虫细胞中得到表达,保持其特有的肝素亲和特性,并具有免疫原性及细胞生物学活性.
