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在LPS刺激的枯否细胞中敲减干扰素调节因子3（IRF3）表达可影响多条信号转导通路
目的：探讨 IRF3 shRNA对脂多糖( lipopolysaccharide,LPS)刺激枯否细胞( Kupffer cell,KC) TLR4信号下游 IRF3-IFN-β、NF-κB/p38 MAPK-TNF-α/IL-1β和 IL-10分子的影响。方法采用在体灌注分离培养大鼠原代KC,并以IRF3 shRNA腺病毒体外感染KC。细胞分4组：1组：腺病毒(-)LPS(-)；2组：腺病毒(-)LPS(+)；3组：腺病毒(+)LPS(-)；4组：腺病毒(+)LPS(+)。 KC培养上清液细胞因子的分泌水平采用ELISA分析；mRNA表达采用real-time PCR检测；KC核蛋白质表达采用 Western blot方法。结果 LPS刺激诱导了原代 KC对 IRF3 mRNA和蛋白质的表达, IRF3 shRNA腺病毒应用后,细胞对IRF3 mRNA的组成性表达及LPS刺激诱导的IRF3 mRNA和蛋白质表达均明显受抑,但对IRF3蛋白质核内组成性表达无明显影响；LPS刺激枯否细胞IFN-β mRNA表达和蛋白质分泌均升高。 IRF3 shRNA应用后,抑制了上述LPS的刺激效应,但对细胞IFN-β的组成性表达和分泌无明显影响；LPS刺激诱导了细胞对前炎细胞因子TNF-α和IL-1β mRNA表达及蛋白质的分泌,IRF3 shRNA腺病毒的应用,抑制了LPS刺激诱导细胞TNF-α和IL-1β蛋白质分泌水平,但对LPS刺激细胞TNF-α和IL-1β mRNA表达以及细胞组成性TNF-α和IL-1β mRNA表达和蛋白质分泌无明显影响；LPS刺激后,细胞IL-10 mRNA表达和培养上清液IL-10蛋白质分泌均显著增加。 IRF3 shRNA腺病毒的应用,促进了LPS刺激诱导KC对IL-10的转录表达和分泌,但对细胞组成性IL-10表达和分泌无明显影响；LPS刺激使核内p-p65和p-p38 MAPK蛋白水平升高,但IRF3 shRNA腺病毒应用对LPS刺激细胞上述分子表达及对细胞组成性表达均无明显影响。结论干扰腺病毒能有效抑制LPS刺激原代枯否细胞IRF3表达及其下游信号转导；IRF3有助于促进LPS刺激KC对TNF-α和IL-1β分泌,但抑制LPS刺激后IL-10的表达；LPS诱导细胞NF-κB和p38 MAPK活化不受IRF3信号影响。
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敲减干扰素调节因子3对脂多糖刺激Raw 264.7细胞核内Irak1bp1表达的影响
目的·扩增干扰素调节因子3(interferon regulator factor 3,IRF3)短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)腺病毒,并研究该病毒对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激诱导Raw264.7细胞核内白介素受体相关激酶1结合蛋白1(interleukin-1 receptor associated kinase 1 binding protein 1,Irak1bp1)表达的影响.方法·IRF3 shRNA腺病毒的扩增在人胚肾293 T(HEK293T)细胞中进行,并采用TCID 50法测定病毒滴度.Raw 264.7细胞随机分为4组,1组为腺病毒(-)LPS(-),2组为腺病毒(-)LPS(+),3组为腺病毒(+)LPS(-),4组为腺病毒(+)LPS(+).细胞IRF3基因表达采用real-time PCR方法检测;核内IRF3及Irak1bp1的表达采用Western blotting方法检测.结果·经计算扩增腺病毒滴度为2.2×1011PFU/mL,佳MOI为300.LPS刺激后Raw 264.7细胞内IRF3 mRNA较对照组明显增加,核内IRF3 蛋白及Irak1bp1表达也明显增加;IRF3 shRNA腺病毒应用后,细胞对IRF3 mRNA的组成性表达及LPS刺激诱导的IRF3 mRNA和核内蛋白质表达均明显受抑,但未刺激状态下IRF3蛋白核内组成性表达无明显影响;IRF3 shRNA 腺病毒应用对细胞静息及LPS刺激诱导的核内Irak1bp1表达并无影响.结论·IRF3 shRNA腺病毒能够有效抑制LPS刺激诱导的核内IRF3的表达,但并不影响核内Irak1bp1的表达.
