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热惊厥幼龄大鼠脑内Prolactin蛋白及Zinc transporter 1 mRNA表达
目的 探讨热应激(Heat stress,HS)和热惊厥(Febrile convulsions,FC)对脑内催乳素蛋白(Prolactin,PRL)和锌离子转运体1(Zinc transporter 1,ZnT1)表达的影响,探讨FC的神经免疫学机制.方法 实验在浙江大学附属邵逸夫医院中心实验室进行.采用热水浴诱导FC模型.21 d龄雄性sD大鼠随机分为正常对照组(8只)和热应激组(28只),28只热应激处理大鼠中15只达到5级(设为热性惊厥组,FC),10只未出现惊厥(设为单纯热应激组,HS),3只达到2级惊厥,弃用.应用免疫组织化学技术对HS和FC大鼠PRL免疫反应性在不同脑区的表达进行分析,原位杂交检测ZnT1表达.各组阳性细胞数采用方差分析进行统计.结果 ①对照组大脑皮层偶见零星表达,着色淡且无定位分布特征.HS组PRL-IR阳性细胞在大脑皮层PIR、Ent和Rs区免疫染色较深,PRH、PAR和Fr区染色较浅;另外PRL-IR阳性细胞还分布于丘脑中线一带;而FC组则于大脑皮层、海马、杏仁核、丘脑及下丘脑见大量PRL-IR阳性细胞,呈弥漫性分布,无明显核团分布特征.②HS和FC两组大脑皮层各区PRL-IR阳性细胞数均明显高于对照组(P<0.01).FC组大鼠大脑皮层PIR、Ent、RS区PRL-1R阳性细胞数与HS组大鼠差异无统计学意义(F值分别为688.9、744.3、0.56,P>0.05),PRH和PAR区FC组明显高于HS组(F值分别为2.68、1.48,P<0.01).③FC组海马区域可见明显ZnT1 mRNA表达,而HS组和对照组无明显表达.结论 ①PfuL在HS组和FC组大脑皮层各区明显表达,而FC组在海马和杏仁核等前脑结构内亦有明显表达,表明PRL不仅与热应激的中枢调控有关,也参与海马等前脑结构对惊厥活动的中枢调控机制.②FC组海马ZnT1 mRNA明显表达提示FC组海马区域存在异常增高的锌离子转运.
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大鼠ZnT1基因siRNA慢病毒载体构建及筛选
目的:构建并筛选针对SD大鼠锌离子转运体1(ZnT1)的siRNA慢病毒载体.并检测其在大鼠神经元中的作用.方法:设计并合成针对ZnT1基因的3条(A,B,C)siRNA序列与1条阴性对照序列,将以上序列退火与pFU-GW-iRNA质粒相连接,通过测序鉴定后,分别与慢病毒包装质粒共感染293T细胞,检测收获病毒滴度后感染体外培养的SD大鼠脑皮层神经细胞,设置感染复数(MOI)分别为1,3,6,8,于转染后72 h计算转染效率.在佳MOI值下,设置未经病毒感染组(CON组)、阴性对照病毒感染组(NC组)和慢病毒阳性干扰组(ZnT1-siR-NA-A组,ZnT1-siRNA-B组,ZnT1-siRNA-C组),72 h后利用Western blot技术检测ZnT1的表达情况,确定对ZnT1蛋白的有效的干扰序列与抑制效率.结果:测序证实目的干扰序列已被准确克隆到pFU-GW-iRNA质粒,收获的慢病毒颗粒滴度为8×108 TU/ml,其在MOI=6时对神经细胞的转染效率高(93％),并保持神经细胞良好的生存状态.转染后ZnT1的表达被不同程度的抑制,A,B,C三种干扰序列对ZnT1的抑制率分别为47.74％±1.40％,81.19％±1.36％,94.10％ ±2.41％.结论:成功构建了ZnT1-siRNA慢病毒载体,其在MOI=6时对神经细胞具有佳的转染效率,并有效沉默神经细胞中ZnT1蛋白的表达.
