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凝胶电迁移率分析法文献资料
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IRAK-M短发夹RNA对RAW264.7细胞内毒素耐受性的抑制作用
目的:观察白介素-1受体相关激酶-M(IRAK-M)基因沉寂后RAW264.7细胞内毒素耐受性的改变, 进而探讨IRAK-M在内毒素耐受形成中的作用.方法:构建表达IRAK-M短发夹RNA(shRNA)的阳性重组质粒(pshIRAK-M-A)和阴性重组质粒(pshIRAK-M-B), 转染RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞系)细胞; 各组细胞经10 μg/L脂多糖(LPS)预处理24 h后(或直接)用100 μg/LLPS刺激; 3 h后, 酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养液中TNF-α水平, 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞中的TNF-α mRNA表达水平, 蛋白印迹法(Western blotting)检测细胞中IRAK-M蛋白的表达, 凝胶电迁移率分析法(EMSA)检测细胞中NF-κB的活性.结果:pshIRAK-M-A对IRAK-M蛋白表达抑制率为83%左右, pshIRAK-M-B对IRAK-M蛋白表达无明显抑制作用; 两种转染细胞在用100 μg/L LPS直接刺激后, 其培养液中TNF-α水平、细胞内TNF-α mRNA表达及NF-κB活性无显著性差异; 两种转染细胞对L P S的再次应答均明显弱于初次应答细胞( P<0.05), 但pshIRAK-M-A转染组细胞对LPS的再次应答明显强于pshIRAK-M-B转染组细胞( P<0.05).结论:IRAK-M表达受抑导致细胞内毒素耐受性减弱, IRAK-M在内毒素耐受形成中起重要作用.
