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gRNA活性文献资料
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CRISPR/Cas9基因编辑系统中两种gRNA活性检测方法比较
目的:比较CRISPR/Cas9系统中gRNA活性检测的两种方法,即利用Surveyor/T7E1核酸酶检测方法或利用Cas9蛋白的体外检测方法.方法:一方面构建表达Cas9和特异gRNA的质粒,转染NIH3T3细胞,然后提取DNA,利用T7E1核酸内切酶检测gRNA介导Cas9切割靶DNA并产生indel突变的效率;另一方面,设计引物并利用PCR扩增出gRNA的DNA模板片段,通过体外转录获得gRNA,利用Cas9蛋白及gRNA进行体外反应检测切割效率.结果:利用Cas9蛋白体外酶切可以检测到较高的gRNA活性,然而通过T7E1核酸酶方法检测gRNA在细胞中活性整体偏低,且在不同基因之间差异较大.结论:细胞Surveyor/T7 E1法与Cas9蛋白体外酶切法检测到的gRNA活性不完全一致,体外活性检测法不能替代.
