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TMEM33 mRNA 3′-UTR报告基因载体的构建及功能验证
目的：：根据microRNA-146a(miR-146a)预测靶点构建荧光素酶报告基因重组质粒并进行功能验证,为研究吸入性损伤中 miR-146a通过靶向跨膜蛋白33(TMEM33)对 Toll 样受体/核因子-κB(TLRs/NF-κB)信号通路的调控作用提供前期的工作基础。方法：通过生物学软件预测 TMEM33 mRNA 3′端非翻译区(TMEM33 mRNA 3′-UTR)可能是miR-146a的作用靶点,将设计合成的TMEM33及其突变序列TMEM33-mu序列分别克隆至荧光素酶报告质粒,采用脂质体法将这两种重组荧光素酶报告质粒 pMIR-TMEM33和 pMIR-TMEM33-mu分别与miR146a mimics共转染 HEK-293T细胞,以 pMIR-TMEM33+miR-control 转染 HEK-293细胞作对照,双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性。结果：TargetScan 和 miRanda 软件预测显示,miR-146a 与TMEM33 mRNA 3′-UTR存在互补结合位点,构建的荧光素酶报告质粒经酶切及测序鉴定正确。双荧光素酶报告基因检测系统显示,miR-146a对TMEM33 mRNA 3′-UTR 具有靶向作用,pMIR-TMEM33+miR146a mimics组较 pMIR-TMEM33+miR-control 组荧光素酶活性降低62%左右,差异具有统计学意义(P<0.01)；而 miR-146a对TMEM33-mu 3′-UTR无靶向作用,pMIR-TMEM33-mu+miR-146a 组与 pMIR-TMEM33+miR-control组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论：成功构建 TMEM33mRNA 3′-UTR 荧光素酶报告载体,证实 miR-146a对TMEM33 mRNA 3′-UTR具有靶向调控作用,为从基因水平深入揭示吸入性肺损伤发病机制提供实验室数据和方法。
关键词： TMEM33 荧光素酶报告基因 微小 RNA-146a 肺损伤 吸入性 -
脓毒症患者血浆 miR-146a 的表达及早期诊断
目的：研究脓毒症患者血浆中 miR-146a 的表达，评价其对脓毒症早期诊断的价值。方法采集脓毒症患者（脓毒症组，30例）及同期进行体检的健康人员（健康对照组，20例）的血标本。采用实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）检测血浆 miR-146a 水平；检测降钙素原（PCT）、C 反应蛋白（CRP）水平，并记录 APACHEⅡ评分。采用受试者工作特征（ROC）曲线评价血浆 miR-146a、PCT、CRP 对脓毒症的预测价值；分析 miR-146a 的表达与 PCT、CRP 及 APACHEⅡ评分的相关性。结果脓毒症组 miR-146a 的表达倍数明显高于健康对照组[（7．03±3．17）比（2．39±1．47），P ＜0．05]，PCT 及 CRP 含量、APACHEⅡ评分亦高于健康对照组（均 P ＜0．05）；且 miR-146a 与PCT、CRP 及 APACHEⅡ评分呈正相关（r 分别为0．767、0．797、0．672）。miR-146a 诊断脓毒症的敏感性和特异性分别为86．67％、45．00％，ROC 曲线下面积（AUC）为0．898。结论血浆 miR-146a 对脓毒症的早期诊断指标具有较高的敏感性及特异性。
关键词： 脓毒症 降钙素原 微小 RNA-146a C 反应蛋白
