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CNP2线粒体定位信号以及磷酸酯酶活性对抑制HIV-1 Gag蛋白组装作用的影响
目的：研究CNP2在线粒体上的定位以及磷酸酯酶活性是否参与抑制HIV-1病毒颗粒组装。方法采用RT-PCR扩增野生型CNP2编码区，插入到真核表达载体pcDNA5，构建融合蛋白Flag-CNP2的表达质粒pcDNA5-Flag-CNP2。应用融合PCR诱导突变法构建CNP1及CNP2突变表达载体。CNP表达载体分别与HIV-1假病毒包装质粒pLP1、pLP2、pLP/VSVG、pLenti6-EGFP共同瞬时转染293T细胞。集落形成实验检测上清病毒滴度，Western blot检测细胞中Gag蛋白p55、p24以及细胞培养上清中p24的表达情况。结果与对照组比较，CNP2、CNP1、CNP2-S9/22A可以显著抑制细胞中病毒的释放，培养上清中病毒滴度显著降低（滴度分别为5.66、4.20、5.75、6.63 Log10IU/ml，NC组为7.65 Log10 IU/ml；t =58.23、17.24、12.77、6.131，P =0.0035、0.0066、0.0004、0.0039）。CNP1抑制HIV-1病毒颗粒组装作用更强，Western blot检测培养上清中病毒蛋白完全p24消失。磷酸酯酶结构域（2HM）突变后CNP2抑制HIV-1病毒颗粒组装的作用显著降低。结论 CNP2抑制HIV-1病毒颗粒组装需要磷酸酯酶结构域（2HM）的参与，CNP2的线粒体定位信号可能会影响其抑制HIV病毒颗粒组装的作用。
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靶向定位的乙型肝炎病毒X蛋白真核表达载体构建及表达
目的 构建带有核定位信号(NLS)和线粒体定位信号(MLS)的乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)真核表达载体,并检测其在人胚肾293FT细胞中的表达和亚细胞定位情况.方法 采用PCR技术分别扩增出增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和HBx序列,人工合成编码NLS和MLS的核酸序列,依次将其克隆至pcDNA4.0载体中.将重组质粒转染293FT细胞,Western blot检测融合蛋白的表达情况,荧光显微镜观察带有定位标签的HBx在细胞中的定位.结果 测序鉴定结果表明带有NLS、MLS和EGFP标签的HBx真核表达载体构建成功,转染293FT细胞能够正常表达融合蛋白,在荧光显微镜下,NLS和MLS能够将EGFP-HBx融合蛋白分别定位于细胞核和线粒体.结论 本研究构建的能够特异性靶向HBx蛋白至细胞核和线粒体的真核表达载体,能够在哺乳动物细胞293FT细胞中表达,为进一步深入研究不同定位HBx的生物学功能奠定了基础.
