首页 > 文献资料
-
iTRAQ技术鉴定TCDD与维甲酸致胎鼠腭裂共同表达的差异蛋白质
目的 应用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术结合质谱分析筛选2,3,7,8-四氯二苯二噁英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-pdioxin,TCDD)与维甲酸致胎鼠腭裂发生的共同差异表达蛋白质.方法 将36只C57BL/6J孕鼠按照随机数表法分为3组,每组12只.分别以28 μg/kg TCDD、80 mg/kg维甲酸在C57BL/6J孕鼠第10.5个妊娠日(gestational day 10.5,GD10.5)灌胃,建立胎鼠腭裂模型,对照组给予等量玉米油灌胃,于GD17.5观察胎鼠腭部的解剖学及组织学改变;取TCDD组、维甲酸组与对照组GD17.5胎鼠的腭组织,从中提取总蛋白质,采用iTRAQ技术联合二维液相色谱-串联质谱分析和鉴定实验组与对照组的差异表达蛋白质;用Western Blot对Annexin A1、14-3-3 sigma差异蛋白进行表达验证.实验数据应用SPSS17.0软件进行统计分析,腭裂发生率的比较采用卡方检验,3组目的蛋白相对表达量比较采用单因素方差分析,方差齐性分析采用Levene检验,组间比较采用Turkey HSD检验,P＜0.05为差异有统计学意义.结果 ①成功建立了胎鼠腭裂模型,TCDD组与维甲酸组腭裂发生率分别为97.1％ (68/70)和98.6％ (70/71),2组比较差异无统计学意义(x2=0.00,P＞0.05),腭裂表型在形态学上相似.②共鉴定出2 996个蛋白质,TCDD组、维甲酸组与对照组比较,分别筛选出差异蛋白75个和90个,2个实验组共同表达的差异蛋白有18个.③Western Blot结果显示,Annexin A1蛋白表达水平对照组为0.52±0.11,TCDD组和维甲酸组分别为0.99 ±0.34和0.98±0.31,分别与对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);14-3-3 sigma蛋白表达水平对照组为0.55±0.15,TCDD组和维甲酸组分别为0.86±0.17和0.93±0,13,分别与对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05),与iTRAQ检测结果一致.结论 应用iTRAQ技术能够快速、有效地筛选TCDD与维甲酸致C57BL/6J胎鼠腭裂发生的共同表达的差异蛋白,这些差异蛋白可能与TCDD、维甲酸致胎鼠腭裂发生密切相关.
-
TCDD诱导的胎鼠腭发育过程中DNA甲基化变化
目的 研究2,3,7,8-四氯二苯二噁英(2,3,7,8-tetrachlrodibenzo-p-dioxin,TCDD)作用于C57BL/6J孕鼠后,胎鼠腭组织基因组DNA甲基化水平变化及DNA甲基转移酶的表达情况.方法 C57BL/6J孕鼠共40只,完全随机分为TCDD组和对照组,每组20只.TCDD组于妊娠第10.5天(GD10.5)以TCDD28 μg/kg一次性灌胃,对照组以等量玉米油一次性灌胃;分别于GD13.5、14.5、15.5、16.5、17.5处死孕鼠,采集各时间点的胎鼠腭组织,分别提取基因组DNA、总RNA.应用MethylampTM基因组DNA甲基化定量试剂盒检测基因组DNA甲基化水平,实时荧光定量PCR检测DNA甲基转移酶Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b mRNA的表达量.应用IBM SPSS 20.0软件进行统计分析,两样本间均数比较均采用独立样本t检验,所有结果作K-S检验均符合正态分布,方差不齐者采用校正t检验,P ＜0.05表示差异有统计学意义.结果 GD13.5、14.5和16.5胎鼠腭组织DNA甲基化水平:对照组分别为33.42％±6.78％、30.12％±3.92％和36.45％±3.27％,TCDD组分别为49.52％ ±4.03％、24.10％ ±2.29％和32.77％±0.98％.GD13.5,TCDD组DNA甲基化水平显著高于对照组组(P＜0.01);而在GD14.5、16.5均低于对照组(P＜0.05).GD13.5、16.5胎鼠腭组织Dnmt1 mRNA表达量:对照组分别为1.01 ±0.10和0.81 ±0.01,TCDD组分别为1.28±0.11和1.04±0.05.在GD13.5、16.5,TCDD组Dnmt1 mRNA表达量高于对照组(P ＜0.05,P＜0.01).GD13.5、16.5胎鼠腭组织Dnmt3a mRNA表达量:对照组分别为0.81±0.02和0.96±0.06,TCDD组分别为1.15 ±0.17和1.11 ±0.06.在GD13.5、16.5,TCDD组Dnmt3a mRNA表达量高于对照组(P ＜0.05,P ＜0.05).GD14.5,对照组Dnmt3b mRNA表达量为0.72±0.06,TCDD组为0.97 ±0.06,TCDD组显著高于对照组(P＜0.01).结论 胎鼠腭组织内可能存在复杂的DNA甲基化调控机制,Dnmt1、Dnmt3a表达升高引起腭组织基因组DNA甲基化水平在GD13.5时显著升高,可能是TCDD导致胎鼠腭发育障碍的表观遗传机制之一.
-
组蛋白H3乙酰化在TCDD致胎鼠腭裂发生中的作用
目的 探讨组蛋白H3乙酰化在2,3,7,8-四氯二苯二噁英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)所致的C57 BL/6J胎鼠腭裂畸形发生中的作用及其机制.方法 共36只C57BL/6J孕鼠,将18只随机分为TCDD组和对照组,每组9只,TCDD组于受孕后第10天(gestation day,GD10)以TCDD 28 μg/kg灌胃1次;对照组于GD10以等量玉米油灌胃;分别于GD13.5、GD14.5及GD15.5处死孕鼠,收集胎鼠的上腭组织提取核蛋白,用比色法检测组蛋白乙酰转移化酶(histone acetyltransferases,HATs)活性.另18只孕鼠随机分为TCDD组和对照组(分组及各组只数同前),分别在上述时间点提取核蛋白,用Western-blot方法检测乙酰化的组蛋白H3(acetylated histone H3,Ac-H3)在上腭的表达情况.结果 各个时间点HATs相对活性在GD13.5,GD14.5、GD15.5所测吸光度A值对照组分别为0.4097±0.0147、0.5223±0.017 1和0.643 5±0.0139,TCDD组分别为0.8650±0.0129,0.719 1±0.0178和0.551 2±0.016 8;TCDD组HATs活性在GD13.5、GD14.5分别高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01);而在GD15.5 TCDD组HATs活性低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01).各个时间点Ac-H3相对表达量在GD13.5,GD14.5、GD15.5,对照组分别为0.745 0±0.113 5,1.055 9±0.249 4和1.795 5±0.081 9,TCDD组分别为1.4490±0.1460,1.6418±0.0997和1.512 l±0.1502; TCDD组Ac-H3表达在GD13.5、GD14.5分别高于对照组GD13.5、GD14.5,差异均有统计学意义(P＜O.01,P＜0.05);而在GD15.5,TCDD组Ac-H3表达低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 组蛋白H3酰化参与了TCDD所致的C57BL/6J胎鼠腭裂的发生,可能是TCDD诱导腭裂发生的机制之一.
-
TCDD诱导C57BL/6J胎鼠腭裂过程中组蛋白H4乙酰化的表达
目的 检测在2,3,7,8-四氯二苯二噁英(2,3,7,8-tetrachlorod-ibenzo-p-dioxin,TCDD)诱导的C57BL/6J小鼠腭裂过程中组蛋白H4乙酰化的表达水平,探讨TCDD诱发腭裂与组蛋白H4乙酰化的相关性.方法 48只C57BL/6 J近交系孕鼠完全随机分为实验组和对照组,在小鼠妊娠第10.5天(gestation day,GD10.5)时,一次性给予孕鼠分别灌服20 μg/kg TCDD(实验组)和等剂量玉米油(对照组),分别在GD13.5、GD14.5、GD15.5剖腹取胎鼠头部标本,作冠状位组织切片,采用免疫组织化学染色观察组蛋白H4乙酰化在腭突中的表达,Western Blotting检测胎鼠腭组织组蛋白H4乙酰化的相对表达量.应用SPSS 24.0进行统计分析,统计方法采用单因素方差分析和方差同质性检验,方差齐采用Bonferroni检验,方差不齐者采用校正t检验,P＜0.05表示差异有统计学意义.结果 组蛋白H4乙酰化主要表达在腭突上皮细胞中,间质细胞少许表达;在腭发育各个主要时期GD13.5、GD14.5、GD15.5腭突上皮细胞的相对表达量分别是:对照组为0.60 ±0.25、0.92±0.09和0.90 ±0.09;TCDD组为1.02± 0.28、1.61 ±0.27和1.28 ±0.13,2组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 TCDD诱导的C57BL/6 J胎鼠腭裂的发生可能与组蛋白H4乙酰化修饰有关.
-
2,3,7,8-四氯二苯二噁英诱导腭裂发生的差异蛋白筛选
目的:以蛋白质组学方法筛选2,3,7,8-四氯二苯二噁英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)致先天性腭裂发生的差异表达蛋白.方法:以TCDD诱导建立胎鼠先天性腭裂模型,行腭部的大体解剖及组织学检查.取实验组和对照组胎鼠的腭组织,分别提取组织总蛋白.通过双向电泳和质谱分析,筛选出实验组和对照组腭组织的差异表达蛋白,并用免疫组化对鉴定出的相关蛋白质进行验证.结果:成功诱导胎鼠腭裂模型.筛选出10种差异表达的蛋白,其中7个蛋白点在试验组上调,3个蛋白点在实验组下调.过氧化物还原酶1 (Peroxiredoxin 1,Prx1)与鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂(GDP-dissociation inhibitor,GDI)在实验组表达明显增强.结论:Prx1、GDI表达的明显增强可能与TCDD所致胎鼠先天性腭裂有关.
