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以双质粒逆病毒载体系统快速建立梯度过表达hMTA1稳转单克隆细胞系的方法
目的 利用逆病毒表达载体快速构建梯度过表达人MTA1稳转单克隆细胞系.方法 利用噬菌斑原位杂交筛选人肺噬菌体文库,以阳性克隆为模板,RT-PCR获得人MTA1完整CDS序列.以逆病毒表达载体pMX为基础,经过多次酶切连接,构建逆病毒表达载体pMX-MTA1-flag-IRES-EGFP.将构建好的逆病毒载体系统,转染293-gag/pol细胞,包装出含该表达载体的逆病毒颗粒.以含病毒上清多次感染HCT116细胞,获得稳定转染MTA1的HCT116多克隆细胞系.将该多克隆细胞系按合适比例稀释后接种至10cm大皿,获得大量单克隆细胞系,以GFP为筛选标志,筛选不同荧光强度的单细胞克隆进行扩增并分析MTA1与GFP表达水平的线性关系.结果 测序结果显示成功克隆出人MTA1表达序列.免疫荧光、Western Blot结果证实成功构建出梯度过表达MTA1的稳转细胞系.相关性验证结果显示构建的非融合载体MTA1与GFP的表达呈明显的线性相关,相关系数r=0.932,P＜0.01.结论 利用逆病毒表达系统,快速成功构建并筛选出MTA1与GFP非融合梯度过表达稳转单克隆细胞系,为MTA1基因功能研究提供了良好模型.该逆转录病毒平台可用于快速建立其他基因的稳转单克隆细胞系.
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DcR3-RNAi-SW480结肠癌稳转细胞模型的建立及方法优化
目的 建立靶向沉默诱骗受体3(decoy rcceptor 3,DcR3)基因表达的DcR3 RNAi-SW480稳转细胞系,并对其条件及方法进行优化.方法 构建靶向沉默DcR3基因的siRNA质粒表达载体,转染SW480细胞,并以G418及流式细胞仪筛选稳转细胞.实验分为3组:DcR3-RNAi稳转组、阴性对照组、空白对照组.蛋白质印记法(Western-blot)检测DcR3蛋白沉默情况.分别应用琼脂糖凝胶电泳、甲基噻唑基四唑(MTT)比色法、流式细胞术等方法对脂质体与质粒的比例、G418的筛选浓度、筛选的佳方式等进行优化.结果 DcR3-RNAi稳转细胞组DcR3表达水平较对照组明显降低；在本实验室条件下,脂质体(μl)与DcR3-siRNA质粒(μg)佳比例为3.5∶1；G418筛选浓度为800 mg/L;G418联合流式细胞仪双筛的稳转细胞比例明显高于仅用G418单筛.结论 成功建立特异性沉默DcR3基因表达的稳转DcR3-RNAi-SW480细胞系；G418联合流式是筛选稳转细胞较高效的方法；对转染及筛选的条件及方法进行优化,可提高转染与筛选效率.
关键词： 结肠肿瘤 受体 TNF相关凋亡诱导配体 RNA干扰 稳转
