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以防御素HD5为效应分子EGFR靶向融合蛋白构建及其抗胰腺癌细胞株活性研究
目的 人α防御素主要由中性粒细胞(HNP1、HNP2和HNP3)和小肠潘氏细胞(HD5和HD6)分泌.HNP1-3可以被作为肿瘤标志物,小剂量的α防御素可以促进肿瘤的增长,大剂量的α防御素可以裂解杀死肿瘤细胞.制备人防御素(human defensin-5,HD5或D5)、力达霉素辅基蛋白(lidamycin apoprotein,LDP)与EGFR配体寡肽(EGFR-di-recting ligand peptide,Ec)组合的融合蛋白Ec-LDP-D5,并初步探讨其抗胰腺癌活性.方法 采用基因工程的方法制备融合蛋白基因,并将其表达纯化得到融合蛋白Ec-LDP-D5.融合蛋白与细胞表面EGFR的亲和活性采用ELISA和细胞免疫荧光化学法;采用CCK-8法测定融合蛋白对人胰腺癌细胞PNAC-1和Aspc-1的体外杀伤活性;流式细胞术检测Ec-LDP-D5蛋白对细胞凋亡的影响.结果 成功构建并表达融合蛋白Ec-LDP-D5,产物主要以包涵体的形式存在,目的蛋白经纯化、复性后,每升发酵液可以获得1 mg纯度达到85％.Ec-LDP-D5可与高表达EGFR的PNAC-1和Aspc-1细胞表面结合.Ec-LDP-D5对PNAC-1和Aspc-1肿瘤细胞有强烈的杀伤作用,Ec-LDP-D5蛋白对Aspc-1肿瘤细胞抑制率为76.8％,与Ec-LDP的抑制率49.4％相比,差异有统计学意义,P=0.038;对PANC-1细胞抑制率为64.6％,与Ec-LDP的抑制率28.3％相比,差异有统计学意义,P=0.042.Ec-LDP-D5在8μmol/L的浓度下即可强烈的诱导细胞发生凋亡,细胞凋亡率(24.6±0.56)％,与Ec-LDP的凋亡率相比P=0.011.结论 本实验制备的防御素融合蛋白Ec-LDP-D5可以与高表达EGFR的PNAC-1和Aspc胰腺癌细胞结合,对胰腺癌细胞具有强烈的杀伤活性和诱导凋亡能力,具有发展为抗肿瘤靶向药物的潜能.
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EGFR靶向HBD-1强化融合蛋白构建及其抗肿瘤活性研究
目的 人β-防御素1(human defensin-β-1,HBD-1)由上皮细胞分泌,在肿瘤细胞中极少表达,新研究表明它可作为肿瘤的抑制基因.本研究制备以人表皮生长因子受体-1(human epidermal growth factor receptor-1,EGFR-1)为靶点、HBD-1(Db)的力达霉素(lidamycin,LDM)组成的强化融合蛋白Ec-LDP(AE)-Db,并探讨其抗肿瘤活性.方法 采用基因工程方法制备融合蛋白基因并将其表达纯化得到融合蛋白Ec-LDP-Db.ELISA和细胞免疫荧光法检测Ec-LDP-Db与肿瘤细胞表面EGFR亲和活性;采用CCK-8法测定Ec-LDP-Db对人肿瘤细胞A431、A549、H460和PG-BE1体外杀伤活性,纯化的Ec-LDP-Db蛋白与LDM发色团(AE)在体外进行组装,构建强化融合蛋白Ec-LDP(AE)-Db.采用MTT法检测Ec-LDP(AE)-Db对肿瘤细胞杀伤活性,A431细胞裸鼠移植瘤实验检测Ec-LDP(AE)-Db体内抗肿瘤活性.流式细胞仪检测Ec-LDP(AE)-Db作用后肿瘤细胞的细胞周期变化.结果 成功构建并表达融合蛋白Ec-LDP-Db,目的蛋白主要以包涵体的形式存在,目的蛋白Ec-LDP-Db经纯化、复性后,每升发酵液可以获得30 mg,检测纯度达到88％.Ec-LDP-Db可与高表达EGFR的A431细胞表面结合.不同浓度的HBD-1和Ec-LDP-Db对A431和H460具有增殖抑制作用,其中10μmol/L Ec-LDP-Db组A431细胞抑制率为(67.3±6.9)％,高于HBD-1组抑制率(13.2±3.7)％,差异有统计学意义,t=1.585,P=0.023;Ec-LDP-Db组H460细胞抑制率为(65.3±2.0)％,高于HBD-1组抑制率(20.5±0.5)％,差异有统计学意义,t=1.895,P=0.045.Ec-LDP-Db蛋白与LDM发色团在体外组装成功后为强化融合蛋白Ec-LDP(AE)-Db.MTT法检测结果显示,Ec-LDP(AE)-Db对肿瘤细胞的杀伤作用比顺铂(cisplatin,DDP)强,DDP对A431的IC50值为(303.2±55.6)×10-10 mol/L,而Ec-LDP(AE)-Db对A431的IC50值为(1.9±2.2)×10-10 mol/L,P=0.043.A431裸鼠移植瘤实验同样证实Ec-LDP(AE)-Db在体内也具有更高的抗肿瘤活性,其抑瘤率为77.8％,P=0.008.流式细胞术检测发现,A431细胞Ec-LDP(AE)-Db给药组1 nM时G2期为(79.1±8.7)％,与对照组(2.9±0.8)％相比,差异有统计学意义(P=0.018),因此Ec-LDP(AE)-Db可以促使A431肿瘤细胞G2/M期阻滞.结论 本实验制备的EGFR靶向强化融合蛋白Ec-LDP(AE)-Db可以与高表达EGFR的A431癌细胞结合,对肿瘤细胞具有强烈的杀伤活性,具有发展为抗肿瘤靶向药物的潜能.
