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MITF基因重组真核细胞表达质粒的构建、表达及意义
目的：通过构建基因MITF及其突变体表达质粒初步研究其外源性表达和定位表达，为研究Waardenburg综合征（Waardenburg syndrome，WS）发病机制提供一定的实验依据和基础。方法通过分子克隆技术双酶切pCMV-MITF和pCMV-Flag后连接构建MITF基因重组真核细胞表达质粒pCMV-MITF-Flag，以其为模板分别构建MITF基因新发突变R217I和T192fs表达质粒pCMV-R217I-Flag和pCMV-T192fs-Flag，DNA测序鉴定。MITF、R217I和T192fs表达质粒分别瞬时转染NIH3T3细胞或黑色素瘤UACC903细胞，Western blot和细胞免疫荧光分别检测和观察野生MITF蛋白和突变R217I、T192fs蛋白的表达和分布。结果MITF及其突变体R217I和T192fs表达质粒经DNA测序鉴定序列正确，三者在黑色素瘤UACC903细胞中正确表达，MITF和R217I仅在细胞核中分布，而T192fs仅在细胞质分布。结论成功构建了MITF基因及其突变体真核细胞表达质粒，突变对MITF蛋白的亚细胞定位产生影响，为在体外实验进一步研究国人MITF基因突变致WS发病的分子机制奠定了实验基础。
关键词： Waardengurg综合征 MITF 基因突变 分子克隆技术 体外实验 -
PAX3基因重组真核细胞表达质粒的构建、表达及意义
目的：通过构建PAX3基因及其突变体表达质粒初步研究其外源性表达和定位表达，为研究Waar-denburg综合征（Waardenburg syndrome ，WS）发病机制提供实验基础。方法通过分子克隆技术双酶切pECE -PAX3和pcDNA3．0-HA后连接构建PAX3基因重组真核细胞表达质粒pcDNA3．0-PAX3-HA ，以其为模板分别构建PAX3基因新发突变H80D和H186fs表达质粒pcDNA3．0-H80D-HA和pcDNA3．0-H186fs-HA ， DNA测序鉴定。将PAX3、H80D和H186fs表达质粒分别瞬时转染小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3细胞），采用Western blot和细胞免疫荧光法分别检测和观察野生PAX3蛋白和突变 H80D、H186fs蛋白在NIH3T3细胞中的表达和分布。结果 PAX3及其突变体 H80D和H186fs表达质粒经DNA测序鉴定序列正确，三者在NIH3T3细胞中正确表达，H80D与PAX3仅在细胞核中分布，H186fs在细胞质与细胞核中均有分布。结论本研究成功构建了PAX3基因及其突变体真核细胞表达质粒，突变对PAX3蛋白的亚细胞定位产生影响，为在体外实验进一步研究国人PAX3基因突变致WS发病的分子机制奠定了实验基础。
关键词： Waardengurg综合征 PAX3 基因突变 体外实验 -
Waardenburg综合征致病基因SOX10重组真核细胞表达质粒的构建、表达及意义
目的 通过构建基因SOX10及其突变体表达质粒初步研究其外源性表达和定位表达,为研究Waardenburg综合征(Waardenburg syndrome,WS)发病机制提供实验基础.方法 通过分子克隆技术双酶切pECE-SOX10和pCMV-Flag后连接构建SOX10基因重组真核细胞表达质粒pCMV-SOX10-Flag,以其为模板分别构建SOX10基因新发突变G37fs、G38fs和E248fs表达质粒,DNA测序鉴定.SOX10、G37fs、G38fs和E248fs表达质粒分别瞬时转染NIH3T3细胞,Western印迹和细胞免疫荧光分别检测和观察野生和突变SOX10蛋白在NIH3T3细胞中的外源性表达和定位表达.结果 SOX10及其突变体G37fs、G38fs和E248fs表达质粒经DNA测序鉴定序列正确,三者在NIH3T3细胞中正确表达,E248fs与SOX10仅在细胞核中分布,G37fs和G38fs在细胞质与细胞核中均有分布.结论 成功构建了SOX10基因及其突变体真核细胞表达质粒,突变对SOX10蛋白的亚细胞定位产生影响,为在体外实验进一步研究中国人SOX10基因突变致WS发病的分子机制奠定了实验基础.
关键词： Waardengurg综合征 SOX10基因 基因突变 体外实验
