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肝脏原位注射新生大鼠肝细胞构建的工程化肝组织对大鼠肝纤维化的影响
目的：观察原位注射新生大鼠肝细胞构建的工程化肝组织对实验性肝纤维化大鼠血清和肝组织学的影响，探讨其抗肝纤维化的作用。方法用四氯化碳制成实验性肝纤维化造模大鼠，肝脏原位多点注射工程化肝组织，3周后测定血清肝功能并行肝组织学检查。结果原位注射组大鼠肝功能较单纯假手术组大鼠有改善，且具有显著差异(P<0.05)，HE染色提示纤维化明显改善。结论肝脏原位多点注射新生大鼠肝细胞的工程化肝组织能改善大鼠肝纤维化进程，有一定抗肝纤维化作用。
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新生大鼠肝细胞分离及体外培养方法
背景:新生大鼠肝细胞是中度分化细胞,兼具肝祖细胞和成熟肝细胞的特性和功能,是研究肝细胞特性的理想细胞来源.目的:探讨新生大鼠肝细胞分离及体外培养方法.设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2008-03/08 在解放军总医院普通外科研究所完成.材料:SD新生大鼠,雌雄不限,3月龄.方法:采用组织块-胰酶冷消化法和多步低速离心获取新生大鼠肝细胞,给予含体积分数10%胎牛血清的HepatoZYME-SFM培养基体外二维培养.采用相差显微镜观察、MTT分析、PAS染色和脲酶法对培养的肝细胞生长及功能进行检测和分析.主要观察指标:肝细胞形态、活性,糖原水平,培养上清中的尿素浓度.结果:分离纯化的新生大鼠肝细胞总数1.0×10~6～2×10~6/肝,活力在90%以上, 光镜下肝细胞呈圆形或卵圆形,核大而圆,胞体较成熟肝细胞小.通过多步低速离心可去除红细胞、其他非实质细胞和死亡的肝细胞,其纯度可达95%以上.肝细胞活性在培养初期即缓慢上升,至第3天时开始快速增殖,第11天时达到高峰,与第1天相比差异有显著性意义(P=0),但随后又缓慢降低,到15天时与第11天相比差异有显著性意义(P=0)培养的肝细胞贴壁生长,并保持肝细胞特异细胞形态.培养至第7天的肝细胞PAS染色呈强阳性,之后阳性细胞逐渐减少,至15 d时可见少量阳性细胞.培养上清中尿素在培养初期基本没有变化,培养至第7天时显著下降.结论:组织块-胰酶冷消化法和HepatoZYME-SFM培养基二维培养为种简单有效的新生大鼠肝细胞分离培养方法.
关键词： 新生大鼠肝细胞 组织块-胰酶冷消化法 体外培养 -
可注射组织工程肝改善大鼠肝纤维化的作用及其机制
目的 探讨可注射工程化肝组织抗肝纤维化作用及其机制.方法 制作大鼠肝纤维化模型,采用新生大鼠肝细胞、液态鼠尾胶原复合物行肝纤维化大鼠肝包膜下多点注射,20 d后计算大鼠生存率、行腹部超声检查、取肝脏观察大体及镜下变化并检测肝组织TGF-β的表达,观察肝脏原位多点注射工程化肝组织对大鼠肝纤维化的影响.结果 实验组大鼠镜下及超声检查提示肝纤维化缓解,TGF-β表达明显下降.结论 原位多点注射基于新生大鼠肝细胞构建的工程化肝组织能缓解肝纤维化,机制可能与其显著抑制TGF-β的表达有关.
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工程化肝组织肝表面片状植入新方法
目的 探索较大尺度工程化肝组织原位肝表面贴覆片状植入、尽快建立血供的可行性.方法 将采用胰酶冷消化法分离的新生大鼠肝细胞(1×1010个/L)、肺组织块贴壁法分离的大鼠微血管内皮细胞(1 ×1010个/L),与片状胶原支架、血管内皮生长因子(VEGF,10g/L)复合构建肝细胞/内皮细胞/血管生长因子/胶原支架复合的片状工程化肝组织.将其在15只大鼠肝表面贴覆植入,4周后取样进行大体观察及组织切片苏木素-伊红(HE)染色.结果 分离的肝细胞及内皮细胞活率均为90％以上.片状工程化肝组织经肝表面贴覆法植入后,大体观察可见能与原位肝脏紧密贴合生长,形成体积大于1 cm3的类肝样组织.体内植入后4周,植入物与肝脏贴合紧密,融合生长.组织学观察显示移植物中肝细胞均匀分布,未见细胞变性及死亡,有血管生成.结论 肝表面贴覆植入法简便安全,可构建较大尺寸的工程化肝组织,有望达到原位修复受损肝脏的目的.
