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磷酸化簇文献资料
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应用酵母双杂交技术筛选和验证与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白
目的 通过酵母双杂交技术筛选与DNA依赖蛋白激酶的催化亚单位(DNA dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)磷酸化簇区域相互作用的蛋白并进行验证.方法 通过酵母双杂交技术,以之前构建的pGBKT7-DPC载体为诱饵,在人肝组织酵母文库中筛选与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白,对筛选出来的阳性酵母细胞克隆进行PCR鉴定、回转验证以及测序分析;构建诱饵蛋白和阳性克隆蛋白的真核表达载体,分别转染至人胚肾293T细胞中,检测诱饵蛋白和阳性克隆蛋白能否正确表达;后将阳性克隆蛋白与诱饵蛋白共转染至293T细胞中,通过免疫共沉淀实验检测阳性克隆蛋白与诱饵蛋白之间的相互作用.结果 经过两轮酵母双杂交实验筛选得到12个文库质粒克隆,通过PCR鉴定确定7个插入片段长度互不相同的文库克隆,对7个文库克隆进行回转验证得到3个与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白,经测序分析显示分别为MBNL1、SIK2和YY1AP1.成功构建诱饵蛋白和3个阳性克隆蛋白的真核表达载体,且均能够在293T细胞中正确表达.免疫共沉淀实验证实筛选出来的3个阳性克隆蛋白均能够与DNA-PKcs磷酸化簇区域发生相互作用.结论 成功筛选到与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白并进行了验证.
关键词： 酵母双杂交 DNA依赖蛋白激酶的催化亚单位 磷酸化簇 相互作用 免疫共沉淀
