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重组酶在胰岛素生产中的应用
本文分别测定了重组的与天然的牛胰蛋白酶和羧肽酶B对前胰岛素融合蛋白的裂解活性.水解产物采用HPLC进行分析,发现重组酶具有更强的活性并且副产物少,因此重组酶在胰岛素生产中比天然的牛胰蛋白酶和羧肽酶B具有更好的前景.
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重组猪羧肽酶原B在大肠杆菌中的表达与复性研究
利用大肠杆菌表达系统,表达猪源羧肽酶原B蛋白包涵体,并对包涵体的体外复性条件进行优化.对猪源羧肽酶原B基因进行没计,优化稀有密码子,并将基因片段插入到pET28a载体中,构建表达质粒pET28a-proCPB,并转化人BL21(DE3)中.通过乳糖诱导表达得到包涵体.通过检测酶的比活力来考查复性液的pH、蛋白终浓度、氧化还原对比例、复性时间、复性温度对复性程度的影响.终确定的体外稀释复性条件为:复性液成份为100 mmol/L Gly-NaOH、pH=9.5、GSH与GSSG的比例为1:0.8(GSH为1 mmol/L)、蛋白终浓度为200μg/ml、复性温度为25℃、复性时间24 h.通过检测,复性液中酶的比活力为11.7 u/mg,经过DEAE纯化后酶的比活力可达到73 u/mg.
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羧肽酶B研究进展
羧肽酶B是重组胰岛素生产中的一个必需工具酶,同时在蛋白质测序等领域中也得到广泛应用.文章综述了羧肽酶B的结构、测活方法、性质、稳定性及储存条件、提取方法、基因工程方法生产羧肽酶B的研究及重组羧肽酶B的性质等.
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重组羧肽酶B及其包涵体溶解性的研究
目的 构建重组羧肽酶B(rCPB)的表达质粒和表达菌株,表达羧肽酶B(CPB),并对表达CPB包涵体的溶解性进行研究.方法 构建CPB重组质粒pET-21a-CPB,将其导入表达菌株BL21(DE3)中,分别在25℃和37℃进行诱导表达;所得包涵体分别用不同浓度尿素添加不同还原剂溶解,以溶液中的蛋白质浓度判定其溶解性,利用非还原SDS-PAGE分析其溶解性提高的原因.结果 诱导后生长温度不同对rCPB包涵体的纯度及后期处理均有影响;rCPB包涵体在10 mol/L尿素溶液中的溶解度比在8 mol/L尿素溶液中提高2～3倍;添加0.75%β-巯基乙醇能显著改善rCPB包涵体的溶解效果.经非还原SDS-PAGE分析,添加β-巯基乙醇后,溶解rCPB聚体的含量减少.结论 成功地表达了rCPB,并通过实验提高了rCPB包涵体的溶解度.
