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第2跨膜结构域文献资料
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三磷酸腺苷结合盒转运体A1蛋白第二跨膜结构域缺失突变体的构建及其抗砷性研究
目的 检测三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)蛋白第2跨膜结构域(the second transmembrane domain,TMD2)中关键的抗砷结构域.方法 采用重叠区扩增基因拼接法构建三磷酸腺苷结合盒转运体A1基因TMD2的一系列缺失突变体,分别转染至HeLa细胞,激光共聚焦观察其定位,Cell Counting Kit-8检测48 h急性砷中毒后生存率的变化,原子荧光吸收光谱法检测细胞内的总砷含量.结果 激光共聚焦证实各突变体的编码蛋白均定位在HeLa细胞的细胞膜上.CCK-8结果显示,转染胞外第4、5环,胞内第4、5环缺失突变体的HeLa细胞IC50分别为33.18、32.84、33.45、34.29 μmol·L-1,与转染野生型三磷酸腺苷结合盒转运体A1质粒的HeLa细胞(IC50为33.96 μmol·L-1)无显著差异,均高于空载体转染对照组(IC50为19.01μmol·L-1).转染胞外第6环缺失突变体HeLa细胞的IC50为19.95 μmol·L-1,与空载体对照组无显著差异,显著低于野生型三磷酸腺苷结合盒转运体A1质粒转染组.原子荧光分光光度法结果显示,转染胞外第6环缺失三磷酸腺苷结合盒转运体A1的HeLa细胞内砷含量与转染空载体接近,而转染其他突变体的结果与转染野生型三磷酸腺苷结合盒转运体A1的结果基本一致.结论 成功构建了5个三磷酸腺苷结合盒转运体A1蛋白第2跨膜结构域的缺失突变体,且其表达的蛋白仍然正确定位于HeLa细胞的细胞膜上.突变体(除胞外第6环外)仍然具有一定的抗砷性,提示三磷酸腺苷结合盒转运体A1胞外第6环可能是关键抗砷结构域.
关键词： 三磷酸腺苷结合盒转运体A1 突变体 重叠区扩增基因拼接法 抗砷性 第2跨膜结构域
