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突变型COL4A5基因编码蛋白片段的表达及圆二色谱结构分析
目的:通过分析COL4A5基因点突变后蛋白结构,探讨基因突变对编码蛋白的基本结构及可能的二级结构的影响.方法:以已确诊的X连锁显性遗传型Alport综合征(Alport syndrome,AS)病人的α5(Ⅳ)链为研究对象,其COL4A5的点突变g.3246 G＞T使编码蛋白的一个甘氨酸被缬氨酸替代p.G1015V.用E. coli.分别表达该病人d5(Ⅳ)链的含有突变位点的结构域及对照α5(Ⅳ)链的同一结构域,圆二色谱检测并比较它们二级结构的差异.结果:病人的圆二色谱低峰所在的波长由对照的200 nm左右,变为220 nm左右,而且峰度降低.二级结构分析显示,来自对照的融合蛋白主要以β折叠和无规卷曲为主,无α螺旋结构,而来自病人的融合蛋白中出现了约占1/8的α螺旋结构.结论:AS时胶原区中的一个甘氨酸被缬氨酸替代后,不仅使发生替代处局部的二级结构发生变化,而且使整个α5(Ⅳ)链的折叠动力学发生改变.异常折叠的肽链会影响链间的相互作用,或者使得三螺旋分子不能正常形成,或者使形成的三螺旋分子结构松散而易被蛋白酶降解破坏,终使肾小球基底膜出现特征性的病理改变.
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检测皮肤成纤维细胞cDNA确定Alport综合征COL4A5基因突变
目的:检测、分析Alport患者Ⅳ型胶原α5链mRNA及其序列,试图建立一种简单、快捷的检测COL4A5基因突变的方法,同时明确基因突变对COL4A5基因转录的影响.方法:取21例X连锁显性遗传型Alport综合征患者和2例对照的皮肤标本培养后提取成纤维细胞总RNA,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR) 和直接测序的方法分析Ⅳ型胶原α5链mRNA.对于cDNA序列异常者,进而应用PCR和直接测序的方法分析COL4A5基因.结果:成功进行了原代、传代皮肤成纤维细胞的培养并提取了总RNA;直接测序揭示对照组Ⅳ型胶原α5链mRNA序列及已检测的8例患者Ⅳ型胶原α5链3′端mRNA 序列与所发表的序列完全一致;通过RT-PCR和直接测序发现了4 例新突变,并与从基因组DNA样本中检测到的突变相一致.结论:通过分析皮肤成纤维细胞中Ⅳ型胶原α5链mRNA序列,可用以检测Alport综合征患者COL4A5 基因突变,且本文报道的4例突变均为新突变;COL4A5基因突变后存在异常的转录产物.
