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HCV协同感染因子La自身抗原、33kDa人类囊相关膜蛋白和真核细胞翻译起始因子第三亚单位特异性siRNAs的筛选
目的 筛选Huh7细胞内La自身抗原、33kDa人类囊相关膜蛋白(hVAP -33)和真核细胞翻译起始因子第三亚单位(eIF2Bgamma)的特异性siRNAs.方法 根据Genebank中的序列设计3种基因的特异性引物,在Huh7细胞中通过荧光定量PCR方法检测上述3种分子；根据siRNA设计原则针对每种基因设计合成3条siRNAs；分别将不同序列siRNA转染Huh7细胞,利用荧光定量PCR方法并计算△△CT值筛选出针对每种基因抑制效率高的一条siRNA.结果 荧光定量PCR方法检测到了上述3种分子的存在；每种基因的3条不同siRNA对相应基因具有不同程度的沉默作用,通过△△CT值的计算找出其中效率高的一条.结论 Huh7细胞内可以检测到La自身抗原、hVAP - 33和eIF2Bgamma基因,其特异性siRNAs可以沉默相应基因表达.
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La、hVAP-33、eIF2B γ和HCV IRES特异性小干扰RNA抑制HCV的复制和表达
目的 证实La自身抗原、33kD人类囊相关膜蛋白(hVAP-33)和真核细胞翻译起始因子第3亚单位(eIF2B γ)是HCV在细胞内的协同感染因子,通过抑制Huh7细胞内这些因子的表达可抑制HCV复制和表达. 方法 分别设计合成3条HCV内部核糖体进入位点(IRES)的小干扰RNA(siRNAs),转染Huh7-HCV细胞后筛选出其中沉默效率高的1条.以HCV假病毒感染Huh7细胞后48 h,分别以上述HCV IRES siRNA和之前试验中已经筛选出的La、hVAP-33和eIF2B γ特异性siRNAs单独或者不同组合转染Huh7-HCV细胞,利用荧光定量PCR方法检测HCV核心基因并计算△△CT值(相对定量法),比较不同siRNAs及组合对目的基因沉默的效率；同时以Western blot观察HCV核心蛋白表达量的差异.结果 La自身抗原与IRES特异性siRNA共转染对HCV表达的抑制效率高,使HCV核心蛋白基因相对表达量下降了约41％；4种基因特异性siRNAs 对HCV在Huh7细胞中的复制和表达均有不同程度的抑制作用,La、hVAP-33和eIF2Bγ特异性siRNAs分别与IRES siRNA联合均较其单独转染对目的基因的抑制效率高.结论 可以认为La自身抗原、hVAP-33和eIF2Bγ是HCV在宿主细胞内的协同感染因子,通过对Huh7细胞内协同感染因子及HCV IRES基因沉默后可以显著减少HCV的表达.
