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人源化乙肝表面抗体重链克隆、表达及免疫学特性初步鉴定
目的 建立一种利用单细胞分选技术克隆人源化乙肝表面抗体重链的方法.方法 从乙肝疫苗接种志愿者外周血中分选得到单个抗体分泌细胞,单细胞RT - PCR筛选20个单菌落,挑选其中有IgG保守区域的克隆全长,并将IgG(H)基因全长克隆到pEGFP -N1载体,转染COS -7细胞,取上清液进行Western blotting验证,并采用Batty饱和法测定亲和力常数.结果 筛选得到IgG(H)能与HBsAg结合,且Ka值达到2.39×109L/mol.结论 利用单细胞分选克隆技术获得的抗体重链亲和力较高.
关键词： 单细胞分选 单细胞反转录聚合酶链反应 乙肝表面抗体 亲和力 -
第三代流式细胞分选仪及96孔板分选单个细胞的方法及参数优化
目的：用第三代流式细胞分选仪比较不同直径喷嘴分选的单细胞的得率及细胞活性，进一步完善单细胞微孔板分选的参数设置及条件优化。方法：用FACSAria Ⅲ流式细胞分选仪及96孔板对Raji细胞、A549、DT 40、RAW 264．7细胞系进行单细胞分选，分别采用70μm 、100μm和130μm喷嘴分选，比较分选后单细胞得率及克隆形成率。结果：在单细胞分选模式下，用3种不同直径喷嘴及96孔板分选后的单细胞得率为86．55％～93．44％，即96孔板有单细胞的孔数为84～92孔；分选后的单个细胞培养7 d后，经70μm 、100μm 和130μm喷嘴分选的单细胞克隆孔数分别为31～52孔、49～70孔、58～78孔。结论：进行单细胞微孔板分选时，在精确调节及优化实验参数的前提下，为了保证单细胞的活性，应优先选择100μm或130μm喷嘴。
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流式细胞仪MoFlo Astrios EQ96孔板单细胞分选方法的条件优化
目的·优化流式细胞仪MoFlo Astrios EQ 96孔板单细胞分选方法,为单细胞技术的应用奠定基础.方法·通过对仪器精确调节及各项参数优化,采用不同孔径喷嘴、不同分选方式对32D、U937、iBMDM和293T共4种细胞进行单细胞分选,观察分选后单细胞孔数以及单细胞所形成克隆孔数.结果·在单细胞分选模式下,70、100 μm喷嘴分选获得单细胞的孔数分别为83～91、87～93孔.分选后的单细胞经7～10d培养后,70μm喷嘴分选获得的单细胞所形成克隆的孔数为36～58孔;100 μm喷嘴条件下电荷式分选、“无电”直接分选获得的单细胞所形成克隆的孔数分别为53～78、69～81孔.结论·进行单细胞分选时,选择100 μm喷嘴和“无电”直接分选方式可得到较好的细胞活性与较高的细胞克隆率.
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人源HBsAb重链体外表达和亲和力、特异性初步鉴定
目的:制备人源HBsAb重链,初步鉴定其亲和力和特异性.方法:利用流式单细胞分选技术获得单个抗体分泌细胞,单细胞RT-PCR筛选单菌落,挑选其中有IgG保守区域的克隆全长,构建IgG(H)基因的表达质粒,转染COS-7细胞并诱导表达.间接ELISA测定检测亲和力,Western blot鉴定抗体特异性.结果:成功构建表达质粒,间接ELJSA显示亲和力Ka值达到2.39 ×109 L/mol,Western blot鉴定重链有较高的特异性.结论:人源HBsAb重链的体外制备对乙肝防治具有重要价值.
关键词： 单细胞分选 单细胞逆转录聚合酶链反应 乙肝表面抗体 亲和力
