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犬MC1R基因多态性的研究
目的利用PCR-RFLP和PCR-SSCP技术分别检测犬MC1R基因中两个序列T105A和R306Ter的基因多态性,为遗传育种、培育出更加优良的实验用犬奠定基础.方法以224只犬为实验材料,对犬MC1R基因T105A片段和R306Ter片段分别进行PCR-RFLP和PCR-SSCP分析,并且分别对具有RFLP和SSCP多态性的片段进行克隆测序,找出等位基因的差异位点.结果经对犬MC1R基因的PCR-RFLP分析,发现犬MC1R基因的T105A序列具有多态性,表现为三种基因型:AA、AB和BB.通过对具有RFLP多态性的片段进行克隆测序发现MC1R基因在编码第105位氨基酸的密码子处存在由G到A的单碱基突变,该突变导致第105位氨基酸发生由精氨酸向苏氨酸的改变,此外在第207位氨基酸的密码子处还发现由A到G的单碱基突变,并产生了一个HhaⅠ限制性内切酶位点.同时,经过犬MC1R基因的PCR-SSCP分析,发现犬MC1R基因的R306Ter序列具有多态性,表现为三种基因型:CC、CD、DD.通过对具有SSCP多态性的片段进行了克隆测序发现,MC1R基因在编码第306位氨基酸的密码子处存在一个由CGA到TGA的终止突变,而使翻译终止.结论利用PCR-RFLP和PCR-SSCP分析技术证实犬MC1R基因具有明显的多态性.
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人恶性黑色素瘤A375细胞黑素刺激素受体(MC1R)的检测
目的检测人恶性黑色素瘤A375细胞膜上MC1R蛋白及其cDNA,为研究黑色素瘤细胞表面受体及靶向配体奠定基础.方法利用放射配体分析法检测人恶性黑色素瘤A375细胞膜上的MC1R蛋白;用RT-PCR方法扩增人恶性黑色素瘤A375细胞MC1R的cDNA,并克隆至pMD-18T质粒,进行酶切分析鉴定及扩增片段DNA序列测定.结果放射配体分析结果表明,125I-αMSH可与人恶性黑色素瘤A375细胞膜特异结合.RT-PCR结果显示,扩增产物的大小与MC1R的cDNA相符.测序结果证实扩增片段为MC1R基因的特异片段.结论证实人恶性黑色素瘤A375细胞膜上表达MC1R蛋白.MC1R基因的成功克隆为其进一步研究提供了必要条件.
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MC1R拮抗/激动剂高通量筛选体系的建立
目的 建立一种进行MC1R拮抗/激动剂快速、高通量筛选,并对其作用靶点进行初步判断的实验体系.方法 利用稳定表达MC1R和诱导表达荧光素酶的MC1R-6CRE-Luci-CHO和仅诱导表达荧光素酶的6CRE-Luci-CHO细胞株为模型,以luciferin荧光素为底物,NDP-a-MSH为激活剂标准品,Sepiwhite(r)为拮抗剂标准品,用SPSS及Graphpad软件进行数据处理,对其主要参数进行优化.结果 其主要参数优化值:NDP-a-MSH浓度0.5 nmol/L;Sepiwhite(r)浓度25 μmol/L;孵育时间5 h;荧光素用量可从厂商推荐的100 μl降到25 μl.结论 本体系能够对MC1R拮抗/激动剂类药物进行高通量筛选及其作用靶点进行初步判断.
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紫外线照射对体外培养人表皮黑素细胞MC1R受体的影响
目的:为了了解紫外线照射对体外培养人正常黑素细胞黑皮质素受体-1(MC1R)的影响.方法:采用MTT法测定UVR照射后黑素细胞增殖情况,以Na0H溶解法测定黑素含量和检测UVR照射后黑素细胞MC1R基因mRNA表达.结果:UVA照射后黑素细胞数量在低照射剂量时升高,高剂量时无明显变化,黑素含量在低剂量时升高,达到一定剂量后将保持稳定；UVB照射后黑素细胞数量在低照射剂量时升高,在照射剂量到达某个临界点后随着照射剂量的增加而迅速降低,黑素含量在低剂量时增加,在高剂量时保持稳定；UVA和URB照射后黑素细胞MC1R基因mRNA的表达均明显高于对照组.结论:不同剂量和不同类型紫外线照射对体外培养人正常黑素细胞的数量、黑素含量及MC1R表达均可产生正性作用.
