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抗肿瘤的人重组内皮抑素基因的克隆及表达
目的克隆抗肿瘤因子内皮抑素基因并表达内皮抑素蛋白重组人内皮抑素(human endostatin,HES).方法从人胎盘组织中分离总RNA,用RT-PCR法扩增出570 bp的DNA片段,经序列测定证实为内皮抑素基因,并成功地克隆到pUC18质粒载体中,用Xpress系统体外表达出内皮抑素蛋白并纯化成功.结果克隆的HEScDNA其序列和国外报道一致;构建了重组HES融合蛋白表达菌株,经SDS-PAGE等分析,表达目的蛋白达细菌总蛋白的40%以上.结论通过HES基因克隆和表达的研究与探讨,得到了HES的基因克隆和高效表达菌株,为内皮抑素在临床治疗恶性肿瘤奠定了基础.
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弓形虫信号转导蛋白14-3-3基因的克隆与表达
目的体外扩增弓形虫RH株信号转导蛋白14-3-3(Toxo 14-3-3)基因编码序列,构建原核表达质粒,并表达Toxo 14-3-3.方法收集、纯化弓形虫RH株速殖子,提取RNA,在设计合成的引物中引入EcoRI和XhoI酶切位点.应用RT-PCR扩增Toxo 14-3-3基因片段,插入原核表达质粒pET28a中,重组子双酶切、PCR和测序鉴定,转化大肠杆菌BL21并以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.结果从弓形虫RH株RNA中扩增出803 bp的Toxo 14-3-3基因片段,构建重组质粒pET28a/14-3-3;IPTG诱导,SDS-PAGE显示表达产物的大小约30.7 kDa,Western印迹鉴定为Toxo 14-3-3.结论成功地从弓形虫RH株基因组DNA中获取了14-3-3基因,构建了pET28a/Toxo 14-3-3重组质粒,并获得高效表达.
关键词： 弓形虫 信号蛋白14-3-3 基因克隆与表达 -
弓形虫表面抗原SAG1基因的克隆及在大肠杆菌中的表达
目的体外扩增弓形虫RH株膜表面抗原SAG1编码基因,构建原核表达质粒,并表达SAG1编码基因序列.方法收集、纯化RH株速殖子,提取RNA,据已知的SAG1基因序列,在设计合成的1对引物中引入EcoRI和HindⅢ酶切位点.应用RT-PCR技术,扩增SAG1基因片段,插入原核表达质粒pET28a中,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,重组子经EcoRI和HindⅢ双酶切、PCR鉴定,转化宿主菌BL21,并以IPTG诱导表达.结果从弓形虫RH株RNA中扩增出1 011 bp的SAG1基因片段,构建重组质粒pET28a/SAG1,酶切和PCR鉴定产物大小均与预期值相符;IPTG诱导,SDS-PAGE显示表达产物的大小约34.8 kD.结论成功地从弓形虫RH株RNA中获取SAG1基因,构建了pET28a/SAG1重组质粒并获得了高效表达,为免疫学诊断和蛋白质疫苗的研究创造了条件.
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Streptomyces sp.4353中3-氨基-5-羟基-苯甲酸(AHBA)合酶基因的克隆及其在大肠埃希菌中的表达
目的 克隆Streptomyces sp.4353中的3-氨基-5-羟基-苯甲酸(AHBA)合酶基因,并将其在大肠埃希菌中表达.方法参与AHBA生物合成的5个基因,即氨基奎尼酸脱水酶基因、氨基奎尼酸/莽草酸脱氢酶基因、AHBA合酶基因、氧化还原酶基因和磷酸酶基因通常连锁,形成一个AHBA生物合成基因簇.本文通过分析、比较已知AHBA生物合成基因簇的基因组织结构特点和序列保守性,设计引物,以Streptomyces sp.4353的总DNA为模板,在已知737bp AHBA合酶基因部分序列的基础上,通过PCR扩增其上、下游DNA序列,克隆至pMD18-T载体上,测序、拼接并进行生物信息学分析.以pET24a(+)为表达载体,对克隆得到的AHBA合酶基因在大肠埃希菌BL21-Codon Plus(DE3)-RIL中进行表达和SDS-PAGE检测.结果从Streptomyces sp.4353中得到了一段2872bp大小的DNA片段(NCBI GenBank接受号EU734184),其中含有AHBA生物合成基因簇中的AHBA合酶基因、氧化还原酶基因和磷酸酶基因(部分);AHBA合酶基因在大肠埃希菌中得到了成功表达,在SDS-PAGE上可见到清晰的、与预计大小(42.7ku)一致的蛋白表达特异条带.结论 Streptomyces sp.4353中的AHBA合酶基因的克隆以及在大肠埃希菌中的表达为进一步研究该基因的功能奠定了基础.本研究克隆得到的2872bp DNA片段还有可能用于AHBA的杂合/异源生物合成,以及安莎类抗生素的组合生物合成.
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人白细胞介素32基因的克隆表达及其生物学活性的研究
目的:克隆人白细胞介素32(hIL-32)基因,构建高效稳定的hIL-32大肠杆菌表达菌株,并对纯化的目的蛋白进行生物学活性的初步测定.方法:将人外周血单个核细胞( PBMC)经刀豆素A( Con A)刺激60 h后提取细胞的总RNA,通过逆转录聚合酶链式反应( RT-PCR)从刺激的PBMC中扩增出hIL-32的基因,通过基因克隆技术,构建hIL-32在pET-30 a(+)中的重组质粒pET30a-hIL32,用IPTG进行诱导,得到hIL-32的原核表达蛋白；采用Ni2+ -NTA亲和层析方法纯化目的蛋白；应用ELISA方法检测纯化蛋白诱导人PBMC产生IL-6的情况.结果:序列测定表明,hIL-32基因核苷酸长度为567 bp,编码189个氨基酸.重组质粒pET30 -hIL32转化至大肠杆菌BL21( DE3),重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量(Mr)为28 000的重组蛋白,表达的重组蛋白IL-32可促进人PBMC产生IL-6,浓度达到(127±4.8)ng/L,而对照组IL-6的浓度仅为(25±2.3)ng/L.结论:成功克隆了hIL-32基因并构建了高效且稳定表达hIL-32基因的大肠杆菌菌株,且表达的目的蛋白能诱导IL-6细胞因子的产生.
