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慢性心衰大鼠心肌2型小电导-Ca2+-激活K+通道及Junctophilin 2表达的改变
目的:检测慢性心力衰竭模型大鼠心肌细胞膜2型小电导-Ca2+-激活K+ (SK2)通道和Jtmctophilin 2 (JP2)蛋白表达的变化,为人类心力衰竭机制的研究和针对性的治疗提供新思路.方法:10只健康成年SD大鼠随机分为假手术组(5只)和手术组(5只),手术组采用腹主动脉缩窄的方法制备慢性心衰模型,假手术组大鼠分离腹主动脉后不进行缩窄术.每周观察各组大鼠心电图的变化,称量大鼠的体重,之后杀死大鼠取心脏和肺称重,计算心脏重量指数和肺系数;提取心脏组织蛋白,用Westem blot的方法检测心肌SK2通道和JP2蛋白的表达水平.结果:术后第8周,手术组大鼠心电图ST段抬高或T波高耸;并且与假手术组相比,手术组大鼠心脏重量指数和肺系数均显著增加;心肌组织SK2通道的表达显著增加,JP2表达下降(P均＜0.05).结论:慢性心衰模型大鼠心肌JP2蛋白表达减小,SK2通道表达增加.
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小电导钙激活钾通道SK2在容量超负荷心力衰竭大鼠窦房结表达的改变
目的 观察小电导钙激活钾通道SK2通道在心力衰竭(HF)大鼠窦房结组织中表达的改变. 方法 以腹主动脉-下腔静脉穿刺造瘘术建立容量超负荷心力衰竭大鼠模型(n=7),假手术对照组(SO)大鼠切开腹腔,穿刺腹主动脉,但不造成腹主动脉-下腔静脉之间的瘘(n=7).于术后8周通过超声心动图测定左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左心室短轴缩短率(left ventricular fraction shortening,LVFS)、左心室收缩末内径(left ventricular end-systolic diameter,LVEDs)、左心室舒张末内径(left ventrieular end-diastolic diameter,LVEDd),并于取材时测定心脏质量/体质量(heart weight/body weight),评价心脏结构与功能改变.分离大鼠窦房结细胞以免疫荧光染色法观察SK2通道蛋白的表达,同时取材窦房结组织,提取组织蛋白,行Western blot测定比较心衰大鼠窦房结组织SK2通道表达的改变情况. 结果 超声心动图结果显示,心力衰竭大鼠心脏收缩功能与舒张功能明显减低[LVEDd(mm):SO 5.91 ±0.36 vs HF 11.15 ±0.91,P＜0.01;LVEDs(mm):SO 2.89 ±0.28 vs HF 7.89 ±0.70,P ＜0.01;LVEF(％):SO 87.10±1.63 vs HF 62.10±2.57,P ＜0.01;LVFS(％):SO51.27 ±2.03 vs HF 30.05 ±1.66,P＜0.01],心脏质量/体质量明显增大(SO 244.19±36.87 vs HF 593.21±28.72,P＜0.01).单细胞免疫荧光染色结果示SK2通道表达于两组大鼠窦房结细胞膜上,Western blot定量分析结果示心力衰竭组大鼠窦房结组织SK2通道蛋白表达水平较假手术组明显减低(0.22±0.10 vs 0.31±0.16,P＜0.05). 结论 SK2通道在心力衰竭大鼠窦房结组织中表达明显下调.
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大鼠H9c2心肌细胞中SK2通道和JP2蛋白的表达及定位
目的:研究大鼠H9c2心肌细胞中SK2通道和JP2蛋白的表达及定位,探讨二者的相互作用.方法:采用Western blot检测SK2通道及JP2蛋白在H9c2细胞中的表达,免疫共沉淀鉴定JP2与SK2通道之间的相互作用,免疫荧光标记观察SK2通道和JP2蛋白在H9c2细胞的定位.结果:心肌细胞H9c2表达SK2通道及JP2蛋白,SK2通道和JP2蛋白可形成免疫复合物,SK2通道和JP2蛋白存在部分共定位.结论:心肌细胞H9c2中SK2通道与JP2蛋白存在相互作用.
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SK2和 JPH2双基因重组真核表达载体的构建及在 HEK293细胞中的表达
目的：构建 SK2和 JPH2双基因重组真核表达载体 pIRES-EGFP／SK2＋JPH2，并检测其在转染后HEK293细胞中的表达。方法：以pCMV6-entry／SK2为模板，PCR扩增出SK2片段，通过BgⅢ／HindⅢ酶切位点克隆入真核表达载体pIRES-EGFP，将JPH2序列插入构建的SK2表达载体pIRES-EGFP-SK2，并通过酶切及测序鉴定。脂质体转染法将重组质粒pIRES-EGFP／SK2＋JPH2转染HEK293细胞，采用 Western blot法检测SK2通道蛋白和JPH2蛋白的表达。结果：构建的重组真核表达载体pIRES-EGFP／SK2＋JPH2经酶切和测序鉴定，证实插入的序列与GenBank中的SK2和JPH2基因序列完全相同。 pIRES-EGFP／SK2＋JPH2质粒转染HEK293细胞48 h后，SK2和JPH2蛋白均能成功表达。结论：成功构建了重组真核表达载体pIRES-EGFPS／K2＋JPH2。
