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突变K-ras基因siRNA腺病毒载体的构建及其对人肺腺癌细胞株H441的影响
目的:构建含12密码子点突变的K-ras基因siRNA腺病毒载体,并研究其对人肺腺癌细胞株H441中突变K-ras基因表达的影响.方法:首先构建含有K-rasV12 siRNA的人H1启动子真核表达载体pSilencerH1/sikrasV12;利用EcoRⅠ与HindⅢ双酶切将人H1载体启动子和K-rasV12 siRNA序列亚克隆至经相同酶切的腺病毒穿梭质粒pAdTrack中,形成转移质粒pAdTrack-H1/siK-rasV12,然后与腺病毒骨架质粒pAd/PL共转染至大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,酶切、序列鉴定.提取含目的基因的腺病毒重组体质粒,经Pac Ⅰ酶切线性化后用脂质体转染293细胞,包装成重组腺病毒AdH1/siK-rasV12,扩增、纯化,并对病毒滴度进行检测.利用得到的重组腺病毒感染人肺腺癌H441细胞株,采用Western blot检测感染前后K-rasV12蛋白表达水平的变化,观察AdH1/siK-rasV12对人肺腺癌细胞K-rasV12表达的影响.结果:成功构建K-rasV12 siRNA腺病毒载体,该载体可明显抑制H441细胞中K-rasV12蛋白的表达.结论:构建的AdH1/siK-rasV12腺病毒能有效抑制突变K-ras基因在人肺腺癌细胞株H441中的表达,为肺癌的基因治疗提供了新的方法和材料.
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PLAGL2基因siRNA表达质粒的构建及体外干扰作用
目的 构建PLAGL2 siRNA表达载体质粒并探讨其体外干扰作用.方法 构建的PLAGL2 siRNA表达载体质粒经脂质体介导转染到小鼠肺Ⅱ型上皮细胞株H441细胞中并获得稳定细胞株,采用实时荧光PCR及Western blot技术分别检测转染组和野生型H441细胞中PLAGL2、SP-C、SP-B mRNA和PLAGL2蛋白表达水平的变化.结果 实时荧光PCR检测结果显示:与野生型H441细胞相比较,PLAGL2 siRNA表达载体质粒转染的H441细胞中PLA-GL2 mRNA水平明显降低(P<0.05),SP-C mRNA水平明显增高(P<0.05),而SP-B mRNA水平没有明显差异(P>0.05);Western blot检测结果显示:与野生型H441细胞相比较,PLAGL2 siRNA表达载体质粒转染的H441细胞中PLAGL2蛋白表达水平明显降低(P<0.05).结论 成功构建了PLAGL2 siRNA表达载体,将其转染至H441细胞中可有效抑制PLAGL2基因的表达,同时促进SP-C基因的表达.
