大肠埃希菌表达的重组生物制品种子批质量控制
摘要： 近年来,DNA重组技术在生物医药领域获得了迅速发展[1-2].《中国药典》三部(2015版)中,对人用重组DNA蛋白制品进行了定义:人用重组DNA蛋白制品是采用重组DNA技术,对编码所需蛋白质的基因进行遗传修饰,利用质粒或病毒载体将目的基因导入适当的宿主细胞,表达并翻译成蛋白质,经过提取和纯化等步骤制备而成的具有生物学活性的蛋白质制品,用于疾病的预防和治疗[3].同时还规定,工程细胞的来源、管理及检定应符合《生物制品生产检定用菌毒种管理规程》和《生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程》的相关要求;对于生物制品生产用重组菌种均应建立种子批系统,通常包括主种子批和工作种子批,从原始种子传代和扩增后保存的为主种子批,从主种子批传代和扩增后保存的为工作种子批,工作种子批用于生产.
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猪圆环病毒2型ORF2与猪繁殖及呼吸综合征病毒ORF5嵌合抗原表位在乳酸乳球菌中的表达
目的 乳酸乳球菌中表达猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)ORF2与猪繁殖及呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)ORF5的嵌合抗原表位.方法 按乳酸乳球菌密码子使用偏好设计并合成PCV2ORF2及PRRSV ORF5的串联抗原表位基因,插入至乳酸菌表达质粒pNZ8148,构建重组表达质粒,转化乳酸乳球菌NZ9000中,经乳酸菌素(nisin)诱导表达嵌合蛋白,采用Ni-NTA亲和层析纯化,进行12％SDS-PAGE分析.结果 重组表达质粒经双酶切鉴定,构建正确.嵌合蛋白相对分子质量约25 000,在乳酸乳球菌中主要以可溶性形式表达,纯化后纯度达96％以上,浓度约1 mg/mL,产量可达60 mg/L细菌培养物.结论 PCV2ORF2与PRRSV ORF5的嵌合抗原表位在乳酸乳球菌中得到高效可溶性表达.
关键词： 猪圆环病毒2型 猪繁殖及呼吸综合征病毒 嵌合抗原表位 乳酸乳球菌 -
重组溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD的构建及其对胃癌细胞的杀伤作用
目的 构建重组溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD,并探讨其对胃癌细胞的杀伤作用及可能的机制.方法 利用同源重组的方法在痘苗病毒VG9的TK区插入锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,MnSOD)基因,构建重组溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD,经筛选及纯化后,测定病毒滴度.将重组溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD及痘苗病毒VG9分别按不同的MOI(0.01、0.1、1、10)及转染时间(12、24、36、48 h)转染至人胃癌细胞株7901,MTT法检测病毒对胃癌细胞的杀伤作用.按MOI=1将重组溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD及VG9分别转染人胃癌细胞株7901 48 h,同时以PBS作为对照,Western blot法检测胃癌细胞中MnSOD的表达,流式细胞术检测胃癌细胞的凋亡情况.结果 经筛选及纯化后,重组溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD滴度为2×108 pfu/mL.MOI为1和10时,重组溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD对胃癌细胞的杀伤作用明显优于VG9(P＜0.05);转染24和36 h,重组溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD对胃癌细胞的杀伤效果明显强于VG9(P＜0.05).转染后,MnSOD蛋白可在胃癌细胞中呈高表达,且VG9-MnSOD组胃癌细胞的凋亡率明显高于VG9组及对照组(P＜0.05).结论 成功构建了重组溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD,其对胃癌细胞具有明显的杀伤作用,该作用可能是通过促进胃癌细胞凋亡产生的.
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2017年黑龙江省禽腺病毒4型分离株Hexon基因的遗传特征分析
目的分析2017年黑龙江省禽腺病毒4型(fowl adenovirus-4,FAdV-4)分离株Hexon基因的遗传特征.方法 提取疑似心包积液综合征(hydropericardium syndrome,HPS)的病鸡肝脏DNA,以其为模板,经PCR扩增Hexon基因,并进行测序.采用BLAST软件对Hexon基因序列进行数据库比对;采用MegAlign软件进行核苷酸和氨基酸同源性比对;采用Mega 6软件将分离获得的FAdV-4菌株及35个参考FAdV菌株的全长Hexon基因构建系统进化树.结果 Hexon基因PCR产物长度为1 204 bp,将分离株命名为FAdV-4-DQ.与其他8个FAdV分离株核苷酸和氨基酸的同源性分别为34.6％ ～ 98.7％和22.0％ ～ 95.7％,其中与中国2015年FAdV-4 HNHB分离株及2016年FAdV-4 HN151025分离株的核苷酸和氨基酸的同源性较高,分别为98.7％、95.7％和98.6％、95.2％;其次是与印度2008年的FAdV-4 PJ-06分离株的核苷酸和氨基酸的同源性较高,分别为98.2％和94.4％.基因进化树分析显示,FAdV-4-DQ株与中国2015及2016年的15个分离株基因型属于同一个进化分枝,并由同一祖先进化.结论 本研究获得的FAdV分离株属血清型FAdV-4型,FAdV-C种,与中国2015及2016年流行毒株同属一个基因簇,并推测该分离株起源于印度早期菌株.
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鲍曼不动杆菌OmpK/Omp22融合蛋白的制备及诱导小鼠抗体应答水平检测
目的 制备鲍曼不动杆菌OmpK/Omp22融合蛋白,并检测其抗原特异性抗体应答水平.方法 以鲍曼不动杆菌标准株19606基因组DNA为模板,通过重叠延伸PCR技术获取OmpK/Omp22融合基因片段,将其定向克隆入原核表达质粒pColdI,筛选重组质粒并进行酶切及DNA测序鉴定.重组质粒转化大肠埃希菌BL21株,经IPTG诱导表达,镍亲和纯化柱纯化重组蛋白.小鼠背部皮下注射重组融合蛋白(20 μg/只,体积50 μL)和等体积完全弗氏佐剂,并于初次免疫后第14和21天相同剂量加强免疫1次,分别于末次免疫后7、21 d小鼠内眦取血,测定小鼠血清中抗原特异性抗体滴度.结果 PCR扩增获得约1 400 bp的基因片段,定向克隆筛选到约5 800 bp的重组质粒,纯化的重组融合蛋白相对分子质量约52 000,小鼠血清中检测到特异性IgG抗体,高抗体滴度可达1:102 400.结论 成功制备了鲍曼不动杆菌OmpK/Omp22融合蛋白,小鼠血清中检测到高滴度特异性IgG抗体,为进一步研究其免疫活性奠定了基础.
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人源化抗血管内皮生长因子单克隆抗体在CHO K1细胞中的表达及鉴定
目的 CHO K1细胞中表达人源化抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)单克隆抗体,并进行鉴定.方法 采用电穿孔转染法将含编码人源化抗VEGF单克隆抗体轻、重链全基因的真核表达质粒DGV-K11转染至CHO K1细胞,经L-蛋氨酸亚砜(methionine sulfoxide,MSX)加压筛选和有限稀释克隆筛选,获得分泌表达人源化抗VEGF单克隆抗体的K11细胞株.利用生物反应器培养K11细胞,采用MabSelect SuRe、DEAESepharose FF和Eshmuno S凝胶色谱纯化培养液,以贝伐珠单抗(Bevacizumab)作为阳性对照,分析人源化抗VEGF单克隆抗体的纯度、电荷异质性、相对分子质量、N-末端序列、等电点及生物学活性.结果 人源化抗VEGF单克隆抗体还原和非还原型CE-SDS分析图谱峰形及电荷异质性与阳性对照相似,轻、重链N-末端氨基酸序列一致;人源化抗VEGF单克隆抗体及阳性对照的SEC-HPLC单体纯度分别为97.46％和97.08％,完整相对分子质量分别为149 201.76和149 201.81,主峰等电点分别为7.31和7.32,生物学活性分别为0.993 × 104和0.960×104 U/mg.结论 于CHO细胞中成功表达了人源化抗VEGF单克隆抗体,与贝伐珠单抗(Bevacizumab)具有相似的纯度、电荷异质性及生物学活性,本实验为CHO细胞大规模表达人源化抗VEGF单克隆抗体奠定了基础.
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丝氨酸-苏氨酸激酶11基因沉默对人前列腺癌RWPE-1细胞侵袭及迁移能力的影响及其作用机制
目的 探讨丝氨酸-苏氨酸激酶11 (liver kinase B1/serine-threonine kinase 11,LKB1)基因沉默对人前列腺癌RWPE-1细胞侵袭及迁移能力的影响及其作用机制.方法 将质粒LKB1-shRNA1及shNC分别转染至RWPE-1细胞中,同时设空白对照组(未转染),经G418筛选出稳定表达细胞株.RT-PCR及Western blot法检测RWPE-1细胞中LKB1基因mRNA转录及蛋白表达水平;划痕试验及Transwell小室试验分别检测LKB1基因沉默对RWPE-1细胞迁移及侵袭能力的影响;RT-PCR及Westem blot法检测RWPE-1细胞中转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)及MMP-9基因mRNA转录及蛋白的表达水平.结果 与shNC组及空白对照组比较,LKB1-shRNA1组RWPE-1细胞中LKB1基因mRNA转录及蛋白表达水平明显降低(P＜0.001);细胞划痕愈合能力及侵袭细胞数明显升高(P＜0.001);TGF-β1、MMP-2及MMP-9基因mRNA转录及蛋白表达水平均明显上升(P＜0.01).结论 LKB1基因沉默可显著提高RWPE-1细胞的转移及侵袭能力,可能是通过上调TGF-β1、MMP-2及MMP-9表达水平产生作用的.
关键词： 丝氨酸-苏氨酸激酶11 基因沉默 前列腺癌RWPE-1细胞 细胞侵袭 细胞迁移 -
人脐血造血干/祖细胞对裸鼠的致突变作用
目的 研究人脐血造血干/祖细胞(HS/PCs-HUCB)对裸鼠的致突变作用.方法 取雄性BALB/c裸鼠,随机分为5组:HS/PCs.HUCB高、中、低剂量组及阴性、阳性对照组,HS/PCs-HUCB高、中、低剂量组分别经尾静脉注射1.25×10~9、3.75×10~8和1.25×10~8个细胞/kg,阴性对照组经尾静脉注射含1%人血白蛋白的0.9%NaCl注射液,50 ml/kg,阳性对照组经腹腔注射环磷酰胺,50 mg/kg,每d给药1次.微核试验连续给药2 d,末次给药24 h后取骨髓细胞涂片,Giemsa染色,每组裸鼠计数12 000个骨髓嗜多染(PCE)中微核细胞数;精子畸形试验连续给药5 d.首次给药后第35天取附睾,精子滴片,伊红染色.每组裸鼠计数1 500个精子的形态.结果 HS/PCs-HUCB各剂量组裸鼠的微核率和精子畸形率与阴性对照组比较,差异均无统计学意义,各组间精子畸形类型构成比差异无统计学意义,畸形精子以无定形为主,其次为无钩、双头、双尾、双体、胖头等;而l;II性对照组的微核率和精子畸形率均显著高于阴性对照组.结论 HS/PCs-HUCB对裸鼠无致突变作用.
关键词： 人脐血造血干/祖细胞 裸鼠 微核 精子畸形 致突变 -
PPE68/Ipr1真核共表达质粒的构建及鉴定
目的 构建结核分枝杆菌PPE68基因和小鼠胞内病原体抗性基因1(Intracellular pathogen resistance 1,Ipr1)的真核共表达质粒,并在小鼠巨噬细胞BAW264.7中表达.方法 将结核分枝杆菌PPE68基因和小鼠Ipr1基因分别亚克隆至含多启动子的共表达载体pBudCE4.1中,构建真核共表达质粒pBud68-Ipr1,转染RAW264.7细胞,通过RT-PCR及Western blot 法检测PPE68和Ipr1基因的转录和表达.结果 重组表达质粒pBud68-Ipr1经PCR、双酶切及测序证实,插入的PPE68和Ipr1基因片段序列正确;质粒转染RAW264.7细胞后,PPE68和Ipr1基因进行了转录和表达,基因编码产物相对分子质量分别为37 000和50 000.结论 已成功构建了真核共表达质粒pBud68-Ipr1,并在RAW264.7细胞中获得表达,为PPE68/Ipr1重组BCG的构建及其免疫保护作用的进一步研究奠定了基础.
关键词： 结核病 PPE68 胞内病原体抗性基因1 巨噬细胞 -
三氟乙酸及甲酸体系下重组人促红素液质肽图的比较
目的 探讨流动相中添加三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)或甲酸(formic acid,FA)时,重组人促红素(erythropoietin,EPO)液质肽图中各肽段的保留时间、峰面积及离子化效率的差异.方法 将重组人EPO样品进行酶切,分别在含0.1％ TFA及0.1％FA的流动相体系下测定液质肽图.通过分析质谱数据对各色谱峰进行定性,记录并计算各肽段的保留时间、峰面积及质谱信号强度.结果 两种添加剂体系下,各肽段的保留时间存在差异,大部分肽段的保留时间变化在1 min左右,个别肽段超过2 min;TFA体系下各肽段的峰面积相对较小,约为FA体系下的84％;FA体系下各肽段离子化效率较高,信号强度一般为TFA体系的6倍,个别肽段高达10倍以上.结论 两种体系下重组人EPO的液质肽图存在较大差异,应根据实验目的选择合适的流动相添加物.
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Arc基因表达及甲基化与幼龄鼠和成年鼠空间记忆形成的相关性
目的 探讨Arc基因表达及甲基化与幼龄鼠和成年鼠空间记忆形成的相关性.方法 应用Morris水迷宫对2月龄幼龄鼠和6月龄成年鼠进行定位航行训练,以判断其空间记忆形成情况.采用RT-PCR检测定位航行训练后大鼠海马组织Arc基因mRNA的转录水平,并对海马基因组DNA进行亚硫酸盐处理,采用甲基化特异性聚合酶链反应(Methylation specific polymerase chain reaction,MS-PCR)检测Arc基因的甲基化情况,并进行DNA甲基化序列分析.结果 随着定位航行训练入水次序及训练天数的增加,幼龄鼠逃避潜伏期缩短(P＜0.05)；而成年鼠在训练当天随着入水次序的增加,逃避潜伏期缩短,但第2天逃避潜伏期不仅与入水次序有关,也随着放入点距离的增大,逃避潜伏期相对延长(P＜0.05),至第3天逃避潜伏期与入水次序及距离均无关,形成稳定的记忆能力.成年鼠定位航行训练组海马组织Arc基因mRNA的转录水平显著高于正常对照组(P＜0.01),且高于幼龄鼠(P＜0.05).与幼龄鼠正常对照组相比,幼龄鼠和成年鼠定位航行训练组第8和24位点均无甲基化,成年鼠定位航行训练组与正常对照组相比,甲基化位点无变化.结论 幼龄鼠瞬时记忆能力接近成年鼠,但形成稳定记忆的能力弱于成年鼠.Arc启动子甲基化影响其mRNA的表达,而Arc基因mRNA的转录水平与大鼠空间记忆能力及年龄相关,进一步证实了甲基化参与调解学习和记忆.
