瑞香素类抗疟化合物的筛选及其靶分子研究
摘要： 目的 通过体外试验和鼠疟动物模型筛选瑞香素结构衍生物的抗疟作用,确定瑞香素类抗疟化合物对恶性疟原虫抗疟作用的靶分子.主要研究内容及方法 (1)在瑞香素基本结构的基础上设计并合成瑞香素的结构衍生物;(2)通过光学显微镜镜检和微量荧光法两种体外筛选系统筛检瑞香素类衍生物对恶性疟原虫的体外抗疟作用;(3)对体外筛检抗疟活性高的化合物,采用WHO推荐的四天抑制试验测定其对鼠伯氏疟原虫(ANKA株)的抗疟作用;(4)以电子自旋共振法测定瑞香素类抗疟化合物对恶性疟原虫核糖核酸还原酶(ribonucleotide reductase,RNR)活性的影响;(5)采用紫外分光光度法测定瑞香素类抗疟化合物对恶性疟原虫细胞色素C氧化酶(cytochrome c oxidase,COX)活性的影响;(6)对体外同步培养的恶性疟原虫经瑞香素、DA78与DA79作用后,抽提总RNA,并合成相应的特异性引物,运用实时荧光PCR法测定瑞香素类抗疟化合物对恶性疟原虫的重要生物功能酶,如RNR、超氧化物歧化酶(superoxidase dismutase,SOD)及乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,L,DH)等基因表达的影响.结果 (1)在瑞香素结构的基础上,通过对7、8位羟基或相邻位点的修饰,共合成32种瑞香素结构衍生物.(2)通过体外筛选系统筛选出DA78与DA79两种新型的瑞香素类抗疟化合物,两者的IC50分别为7.6μmol/L、1.4μmoL/L,其体外抗疟活性与瑞香素的差别无统计学意义(P＞0.05);体内试验按D4减虫率评价,瑞香素、DA78与DA79灌胃给药在鼠伯氏疟原虫ANKA株感染小鼠中,DA79在1、10、50、75 ms/(kg·d)×4 d组与对照组1%西黄蓍胶相比较差异有统计学意义(P＜0.01),而DA78在50或75 mg/(kg·d)×4 d的抗疟作用与对照组相比较差异有统计学意义(P＜0.05);另外DA79在10或75 mg/(kg·d)×4 d的抗疟效果要优于同剂量的瑞香素(P＞0.05).(3)体外同步培养的恶性疟原虫经100μmol/L瑞香素2、4、8和12 h作用后,COX活性依次下降了0、6%、、73%和80%,在瑞香素浓度为100 nmoi/L、lμmoL/L、100 μmol/L与l mmol/L作用6 h后,COX活性依次下降了3%、31%、53%和84%(n=3),其活性随着瑞香素浓度的增高基本成线性降低,而当瑞香素的铁鳌合能力饱和后对COX活性的影响几乎消失;100 μmol/L DA78与DA79作用2、4、8和12 h后,COX的活性依次下降了0、2%、11%、9%与7%、13%、17%、32%,在DA78、DA79浓度为100 nmol/L、1 μmol/L、100 μmol/L与1 mmol/L作用6 h后,COX活性依次下降了0、0、4%、13%与1%、4%、15%、29%,其活性随着DA78或DA79浓度的增高基本成线性降低,其中DA79对COX的抑制作用高于DA78,但两者均低于瑞香素对COX的作用(n=3,P＜0.01).(4)体外同步培养的恶性疟原虫经瑞香素、DA78与DA79作用后.以电子自旋共振法测定不同时间恶性疟原虫酪氨酸的量以反映RNR的活性,经100 μmol/L瑞香素作用1、2、3和4 h后,相对于对照组的值RNR的活性依次为其值的93%、49%、31%和25%,在瑞香素浓度为100 nmol/L、1 μmol/L、100 Vanol/L与1 mmoL/L作用6 h后,相对于对照组的值RNR的活性依次为其值的97%、69%、42%和7%;RNR的活性随着瑞香素浓度的增高而降低,但并非呈线性相关.当瑞香索铁鳌合能力饱和后,恶性疟原虫RNR活性几乎未受影响(n=3,P＞0.05).经100μmot/L DA78与DA79作用1、2、3和4 h后,相对于对照组的值恶性疟原虫RNR的活性依次为其值的98%、96%、87%、71%与93%、44%、41%、23%,DA79对RNR活性的抑制作用高于同剂量相同作用时间DA78的作用(n=3,P＞0.01),DA79与瑞香素在体外对恶性疟原虫RNR抑制作用的差别无统计学意义(n=3,P＞0.05);在DA78与DA79浓度为100 nmol/L、1μmol/L、100μmol/L与1 mmol/L.,作用6 h后,相对于对照组的值RNR的活性依次为其值的100%、92%、64%、61%与97%、48%、25%、4%,DA79对RNR活性的抑制作用高于同剂量DA78的作用(n=3,P＜0.01),并且高于同剂量瑞香素对RNR活性的抑制作用(n=3,P＜0.05).(5)恶性疟原虫体外经瑞香素、DA78与DA79作用后,LDH、SOD与RNR 3种基因扩增的标准曲线,在105～109 copies/ml范围内标准曲线呈良好的线性关系,其基因扩增产物的标准曲线的r2依次为0.9907、0.9983、0.9975.根据标准曲线计算各组样品3种基因的原始拷贝数来比较各组3种基因表达量的差异,不同处理组对恶性疟原虫LDH基因的表达无显著性抑制作用(n=3,P＞0.05),而且各组间差异无统计学意义(n=3,P＞0.05);瑞香素、DA78与DA79对恶性疟原虫RNR基因的表达均有抑制作用;只有瑞香素对恶性疟原虫SOD基因表达产生抑制作用,其他各组无显著性抑制作用;但瑞香素的铁螯合能力饱和后,对上述3种基因的表达均未产生显著性抑制作用(n=3,P＞0.05).结论以DA78与DA79为代表的瑞香素类衍生物作为一类新型的抗疟化合物,在体外和体内试验中均显示出一定的抗疟活性;RNR很可能作为瑞香素类抗疟化合物抗疟作用的靶分子.本研究首次发现两种瑞香素结构衍生物DA78与DA79具有与瑞香素同一水平的抗疟活性,为寻求更有效的抗疟化合物提供了方向,并利用分子生物学方法对瑞香素抗疟化合物抗疟作用的靶分子进行了筛选与研究,初步确定了RNR作为瑞香素类抗疟化合物抗疟作用的靶标,为今后瑞香素类抗疟药物的进一步开发提供了理论依据.
-
弓形虫感染对宿主T细胞功能的影响
刚地弓形虫病对人类健康和畜牧业的发展危害严重.宿主T细胞介导的细胞及体液免疫在抗弓形虫感染中发挥着重要的作用.大量研究表明弓形虫感染能够通过凋亡或衰竭等方式导致宿主T细胞数量减少、功能受损,是弓形虫逃避宿主免疫的重要表现.该文就弓形虫感染对宿主T细胞的影响做一综述.
-
顶复门原虫AP2蛋白家族研究进展
顶复门原虫是一类专一性的细胞内寄生原虫,包括许多重要的人畜寄生虫,如弓形虫、隐孢子虫、疟原虫、巴贝虫及艾美球虫等.顶复门原虫感染与致病的研究一直是重点和热点,但关于顶复门寄生虫转录调控的分子机制仍然知之甚少.以往研究表明DNA结合蛋白中,顶复门AP2 (apicomplexan apetela 2,ApiAP2)家族可能是一类重要的转录调控因子.该文结合近几年的研究结果,对该蛋白家族的新研究进展进行综述.
-
巴贝虫感染的免疫应答
巴贝虫的感染伴随着复杂的免疫应答过程,现有的研究显示机体的免疫力与巴贝虫感染的发生、发展、愈后有着密切的关系.该文主要是从巨噬细胞、自然杀伤细胞的固有免疫应答及B细胞、T细胞等的获得性免疫应答等方面来阐述机体感染巴贝虫后的免疫作用及其机制.
-
重组人 CXCR1/2拮抗剂 G31P 在人类疾病防治应用的研究进展
G31P （重组人CXCR1/2拮抗剂）是一种相对分子质量低的蛋白质，能与IL-8竞争结合其受体，导致IL-8与受体的生物学活性丧失，从而阻断中性粒细胞的趋化性及其引起的非特异性免疫应答，从而控制宿主炎症的发展。近年研究发现IL-8和其受体在肿瘤、心血管疾病和炎症反应性疾病，以及旋毛虫病和血吸虫病等疾病中高表达。探讨应用G31P控制炎症发展，以达到防治疾病的目的已成为目前国内外学者研究的热点之一。
-
钩虫病检测方法研究进展
钩虫病呈全球性分布，严重影响人类健康，是引起重要公共卫生问题的被忽略的热带病之一。钩虫病的检测对控制钩虫病流行至关重要，因此，钩虫病的检测方法的研究受到高度重视。该文就钩虫病检测方法研究进展作一综述。
-
血吸虫病临床检验现状与研究进展
血吸虫病为目前严重危害人体健康的主要寄生虫病之一,早期诊断对于血吸虫病治疗意义重大.目前常用的临床检验方法包括病原学检测、免疫学检测及分子生物学检测.各种检测方法均有其适用范围及优劣势.该文总结分析近年来血吸虫病临床检验的常用方法,以指导临床合理选择检测方法.
-
HIV感染者弓形虫伴随感染的分子流行病学状况
弓形虫是一种重要的机会性致病原虫,是艾滋病患者常见的一种机会性感染寄生虫,其感染率占全部机会性感染的10％～30％.通常根据基因型的不同将弓形虫分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型,HIV感染者感染的弓形虫多为Ⅰ型,Ⅰ型弓形虫与其它类型弓形虫的致病性有很大差异,造成差异的根本原因是致病基因的不同,这些差异基因主要包括SAG1、SA G2、B1等.该文从弓形虫感染现状、伴随感染弓形虫的主要类型和各个类型之间的差异基因等方面,阐述HIV感染者弓形虫伴随感染的分子流行病学状况.
-
沃尔巴克氏体诱导细胞质不相容的模型和分子机制研究进展
由蚊媒传播的疾病,如疟疾、登革热、流行性乙型脑炎、黄热病等已严重影响人类健康,但至今尚无有效的防治方法.沃尔巴克氏体是在自然界中广泛存在的、经母系遗传的共生菌,可诱导蚊群产生胞质不相容.迄今为止,胞质不相容的分子机制尚未明确,但“锁-钥匙”模型(lock and key model)、“移除-归还”模型(titration-restitution model)和“减速”模型(slow-motion model)可在一定程度上解释胞质不相容现象.胞质不相容产生的整个过程极为复杂,是多种因子共同作用的结果.该文就胞质不相容的模型及分子机制进行综述.
-
旋毛虫传播途径及对宿主影响的研究进展
旋毛虫病是一种严重的食源性人兽共患寄生虫病,呈世界性分布.旋毛虫的传播途径主要为水平传播,但也可以通过机械传播和垂直传播感染宿主.旋毛虫对患者的消化系统、循环系统、神经系统、骨骼肌等系统产生不同程度的损害,严重影响人类的健康.该文综述了旋毛虫的传播途径及其对宿主的影响.
-
我国常见蜱的生物学特性及其传播疾病研究进展
蜱是以吸食动物血液为生的寄生生物,可以传播多种病原体,引起宿主患病.我国蜱种多样,分布广泛,多种蜱具有医学重要性.现就我国常见蜱种的生物学特性及其可传播疾病作一综述.
