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hPARP-1蛋白缺陷细胞株建立及生长特性
目的建立hPARP-1蛋白缺陷细胞株,观察该缺陷所引起的生物学效应.方法用构建的hPARP-1基因反义RNA绿色荧光蛋白真核表达载体(pEGFP-C1-P)转染人胚肺成纤维细胞(HLF),用蛋白免疫印迹法鉴定转染细胞中hPARP-1基因的表达水平.同时观察转染细胞生长形态,绘制生长曲线,用流式细胞术观察细胞周期,软琼脂培养法鉴定转染细胞恶性程度.结果pEGFP-C1-P载体在转染细胞内可较稳定表达,hPARP-1蛋白缺陷细胞株hPARP-1基因的蛋白表达水平比HLF下降了47%,比绿色荧光蛋白载体(HLFC)低45%,HLFC比HLF仅少3%.转染后hPARP-1蛋白缺陷细胞生长形态、生长速度无明显变化,软琼脂培养未见细胞集落.hPARP-1缺陷细胞生长形态无明显变化,细胞倍增时间为0.89 d,与HLF细胞0.93 d接近,软琼脂培养未见细胞集落.结论成功建立和鉴定了hPARP-1蛋白缺陷细胞株,在正常生长环境中,该缺陷不足以单独引起可观察的生长特性改变.
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hPARP-1基因cDNA翻译起始区域的T载体克隆
目的克隆及构建含限制性内切酶位点BamHⅠ、SacⅠ的人聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(hPARP-1)基因cDNA翻译起始区域的pGEM-T-S载体,为以后的亚克隆和毒理学研究提供实验材料.方法采用RT-PCR方法,用正常人胚肺成纤维细胞(HLF)抽提的总RNA逆转录成cDNA,再以cDNA为模板,扩增hPARP-1基因片段,并直接与T载体连接后转化大肠埃希菌DH5α,用蓝(白)斑试验筛选出阳性克隆,抽提重组质粒并进行PCR及酶切鉴定,再行序列分析.结果经RT-PCR获得507 bp含限制性内切酶位点的阳性产物,T载体克隆、PCR及酶切鉴定和序列分析后证实,克隆片段与Genbank中该基因的序列同源性为99.9%.结论该实验成功地构建了含hPARP-1基因cDNA翻译起始区域的T载体克隆,为亚克隆及缺陷细胞株的建立提供工具.
