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aFGF对染铅大鼠脑神经元细胞膜蛋白激酶C活力的影响
目的通过测定酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)对染铅的原代培养大鼠脑神经元细胞膜蛋白液酶(PKC)活力的影响,探讨aFGF在铅中毒时对神经元细胞的保护作用.方法细胞培养7 d后,用0.6μg/L aFGF及不同浓度铅处理细胞,用改良的Takai法测定PKC活力.结果神经元染铅30 min,在0.1～5.0 μmol/L铅浓度范围内,胞膜PKC比活性明显升高,尤其1.0μmol/L时高.用aFGF预处理后再染铅时,铅浓度0～0.1μmol/L时胞膜PKC比活性升高,在1.0～5.0 μmol/L时与对照组比较无明显变化.结论细胞膜PKC比活性可随着染铅浓度不同而发生改变.aFGF可保护神经元避免铅对胞膜PKC活力的影响.
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苯并[a]芘对原代培养大鼠神经元细胞损伤及Hsp70表达的影响
目的 研究苯并[a]芘(B[a]P)对体外原代培养大鼠神经元细胞损伤及热休克蛋白70(HBpT0)表达的影响.方法 分离培养l -3 dSD大鼠皮层神经元细胞,不同剂量B[a]P+s9染毒处理24 ho光镜观察神经细胞的形态学变化,MTT法检测细胞活性,紫外分光光度法检测细胞培养液中LDH活力和MDA的含量,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,碱性单细胞凝胶电泳检测细胞DNA损伤情况,Western blot法检测细胞Hsp70的表达水平.结果 随着B[a]P剂量的增大,神经元细胞的轴突和树突的数量减少,长度缩短,部分细胞出现空泡化,细胞活力下降.培养液中LDH活力、MDA含量和细胞Olive尾距、细胞凋亡率均随B[a]P剂量增大而升高,0.5～10 μmol/L组与Oμmol/L组比较,差异均有统计学意义(P<0.05).0.5～10 μmoL/L组神经细胞Hsp70表达水平随剂量增大而下降,显著低于0.1μmol/L组(P<0.05),10 μmol/L组显著低于0μmol/L组(P<0.05).相关分析显示,MDA与LDH、Olive尾距、细胞凋亡率呈显著正相关,与细胞活力、Hsp70表达水平呈显著负相关.HspT0表达水平与LDH、Olive尾距、细胞凋亡率呈显著负相关,与细胞活力（A值）呈显著正相关.LDH、Olive尾距与细胞凋亡率之间呈显著正相关.结论 B[a]P代谢产物可导致体外原代培养神经元细胞损伤和凋亡,抑制Hsp70表达.BEa]P抑制Hsp70表达可能与其神经毒性有关.
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洋葱中黄酮类提取物对血脑屏障透过及神经保护作用研究
目的 研究采用乙醇回流法从洋葱中提取的黄酮类物质对血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)透过作用以及对原代培养的鼠神经元细胞增殖和凋亡的影响.方法 首先原代培养成功SD鼠脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMVECs)；然后原代共培养鼠BMVECs和星形胶质细胞(astrocytes,ACs)以建立BBB体外模型.采用乙醇回流法从洋葱中提取黄酮类物质,通过透射电子显微镜观察和跨膜电阻值测量验证BBB模型；采用高效液相色谱(HPLC)检测黄酮类提取物对BBB的透过率.采用过氧化氢(H2O2)和黄酮提取物处理神经元细胞,MTT法观察其对细胞增殖和凋亡的影响；彗星电泳和免疫荧光法分析神经元细胞DNA损伤情况.结果 透射电镜及跨膜电阻仪鉴定BBB体外模型构建成功；HPLC检测洋葱中黄酮类提取物BBB透过率为60.58％；该提取物在10 ～ 20 μg/mL浓度对H2O2诱导的鼠神经元细胞凋亡有明显的抑制作用,并可减少神经元DNA损伤.结论 采用乙醇回流法从洋葱中提取的黄酮类物质可有效透过BBB,并对H2O2诱导的鼠神经元细胞的凋亡和DNA损伤有明显抑制作用.
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乳鼠海马神经元细胞元代培养及AD损伤模型制备
采用乳鼠海马做神经元细胞的原代培养和鉴定,并利用Aβ25-3损伤处理细胞,制备AD损伤细胞模型,为后继研究中药脑脊液和血清对神经元保护试验的奠定前期基础.
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何首乌有效成分二苯乙烯苷对Aβ25-31诱导神经干细胞定向分化的影响
目的 探讨何首乌有效成分二苯乙烯苷(TSG)对β-淀粉样肽(Aβ25-31)诱导神经干细胞(NSCs)定向分化的影响.方法 从孕14d昆明小鼠体外提取并培养NSCs,分别建立起两组分化系统可溶性Aβ25-31体外诱导NSCs损伤的阿尔茨海默病(AD)细胞模型:神经元细胞分化模型M1(Aβ25-312 5 μmol/L)、星形胶质细胞分化模型M2(Aβ25-3.5μmol/L).TSG低、中、高剂量组(TSG浓度分别为10-8、10-7、10-6mol/L)分别干预模型M1和模型M2,采用WST-1细胞增殖及细胞毒性试剂盒检测各组NSCs细胞活性,采用免疫荧光法及蛋白印迹法观察各组GFAP、Tubulin阳性细胞率及其蛋白表达情况.结果 模型M1组和模型M2组细胞活性A值较相应的对照组明显降低(P＜0.05);TSG中、高剂量组A值明显高于相应的模型组(P＜0.05).与相应的对照组比较,模型M1组Tubulin阳性细胞率及其蛋白相对丰度值明显降低,模型M2组GFAP阳性细胞率及其蛋白相对丰度值明显升高(P＜0.05);与相应的模型组比较,TSG高剂量组Tubulin阳性细胞率及其蛋白相对丰度值均显著升高,GFAP阳性细胞率显著降低(P＜0.05).结论 高剂量的TSG具有促进Aβ25-31诱导的NSCs向神经元方向分化的趋势,抑制向星形胶质细胞的分化.
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羊瘙痒因子263K感染仓鼠脑组织中兰尼碱受体2表达变化的研究
目的 探索RyR2在朊病毒感染金黄仓鼠脑组织中的表达变化.方法 通过免疫组织化学染色观察到RyR2在正常仓鼠及263 K毒株感染仓鼠的脑区分布情况;通过免疫印迹方法观察到正常及263 K毒株感染仓鼠终末期脑组织中RyR2表达变化情况;通过免疫荧光双标染色检测RyR2是否与朊蛋白存在共定位关系.结果 RyR2主要分布在仓鼠的小脑浦肯野细胞、大脑皮层,而在海马、下丘脑和嗅球也有表达.263 K毒株感染仓鼠终末期脑组织中,RyR2表达显著下降;免疫荧光双标染色发现,RyR2与朊蛋白存在共定位关系.结论 RyR2的表达在朊病毒感染的金黄仓鼠中变化明显,可能与认知功能的下降及神经元调亡有关.此研究为进一步探讨RyR2在朊病毒病中的作用和分子机制提供了一定基础.
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乌司他丁对心肺复苏后兔脑损伤和心功能的影响
目的 观察乌司他丁( ulinastatin,UTI)能否抑制自主循环恢复(restoration of spontaneous circulation,ROSC)后新西兰兔血浆致炎因子TNF-α、IL-6水平的升高,改善心功能、保护海马CA1区神经元细胞.方法 建立新西兰兔心搏骤停模型,ROSC后随机(随机数字法)分为对照组和UTI治疗组.观察ROSC后血浆TNF-α和IL-6水平的变化,监测心肌收缩和舒张功能；观察海马CA1区神经元细胞损伤和各主要脏器炎症细胞浸润的情况.依据正态检验结果用t检验或秩和检验( Mann-Whitney rank),多重比较用POST HOC检验,炎症因子和心功能的相关分析采用Pearson相关分析.结果 UTI显著抑制ROSC后TNF-α和IL-6水平的升高,UTI组ROSC后各时间点TNF-α和IL-6水平均低于对照组.UTI组动物ROSC后4、8、12 h的左心室射血分数(EF)、二尖瓣E/A峰比值高于对照组,左心室缩短分数(FS)值在ROSC后4、8h高于对照组,差异具有统计学意义(P＜0.05).Pearson相关分析表明ROSC后TNF-α和IL-6水平与EF明显相关.CA1区有活力的神经元细胞数对照组为(13.22 ±0.97),UTI组为(16.89±1.45),差异具有统计学意义(P=0.003);对照组的凋亡神经元细胞数为(15.67±1.37),UTI组为(13.67±1.03),差异具有统计学意义(P =0.019).UTI可以减轻ROSC后肠道、肝脏和肾脏内炎症细胞的浸润.结论 UTI通过减轻ROSC后兔肠道、肝脏和肾脏内炎症细胞的浸润,使血浆致炎因子TNF-α和IL-6水平降低,从而改善心功能和保护海马CA1区神经元细胞.
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原子力显微镜下观察急性压力损伤后脊髓背根神经节神经元的结构变化
目的:利用脊髓背根神经节神经元细胞体外机械压力损伤模型,探计单纯机械压力因素对背根神经节神经元细胞的损伤效应,尤其是细胞膜骨架蛋白的变化情况.方法:新生SD大鼠脊髓背根神经节神经元体外原代培养,利用多功能全自动细胞压力仪(国家实用新型专利ZL 200820030390.7),将培养细胞分为A、B、C、D四组,其中A组为未施加机械压力损伤的对照组,B、C、D组分别给予0.3mPa、0.5mPa.、0.7mPa的压力损伤10min,每组观察细胞爬片6个,于加压后培养8h取细胞爬片固定,送原子力显微镜检测,观察神经元细胞的细胞膜骨架蛋白纳米级变化情况,获取并分析胞膜表面颗粒高度分布数据及原子力显微镜图片.结果:对照组细胞膜表面平滑,无明显粗糙颗粒；0.3mPa组细胞膜表面颗粒突起较对照组增多,膜颗粒总体高度增加,局部变粗糙,胞膜上蛋白高度分布直方图峰值右移；0.5mPa组较0.3mPa组胞膜粗糙度更加明显；0.7mPa组膜表面蛋白颗粒总体高度较0.3mPa及0.5mPa组降低,粗糙颗粒减少,但出现胞膜骨架蛋白解聚与构像变化,胞膜出现孔道样改变.胞膜颗粒高度分布峰值、分布宽度及高颗粒值的单因素方差分析显示,压力损伤各组间及损伤组与对照组均有统计学差异(P＜0.01).结论:机械压力损伤因素可引起细胞膜骨架蛋白变化和表面颗粒高度变化,为压力损伤的细胞保护研究提供了实验数据.
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脂多糖应答基因对神经元细胞类缺血再灌注损伤的影响
目的 研究神经元细胞中脂多糖应答基因(LRG)的表达对细胞类缺血再灌注损伤的影响.方法 将小鼠神经元细胞分为对照组和处理组,处理组给予体外类缺血再灌注处理,采用定量PCR(qPCR)和Western blot的方法检测细胞中LRG基因的表达.将原代培养的神经元细胞分为空白组、空载质粒组、过表达组、非特异小干扰RNA(siRNA)组、沉默组,过表达组/沉默组转染LRG基因过表达质粒或siRNA,采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞经类缺血再灌注后的生长状况,同时利用Western blot分析细胞中活化蛋白激酶B(pAkt)的表达.将原代培养的神经元细胞再分为阴性对照组、过表达组和抑制剂组,抑制剂组利用20 μmol/L LY294002抑制细胞中磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)的正常功能,MTT法分析过表达LRG基因的细胞体外生长状况,同时利用Western blot方法分析细胞中活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)3的表达.结果 与对照组相比,类缺血再灌注处理显著降低细胞中LRG基因的表达(P＜0.05).过表达LRG基因可显著提高缺血再灌注损伤细胞在体外的存活(P＜0.05),而沉默LRG基因则降低细胞的存活(P＜0.05).同时,过表达LRG基因上调细胞中pAkt的表达而沉默LRG基因则下调pAkt的表达(P＜0.05).抑制神经元细胞中PI3K可降低缺血再灌注损伤后细胞的存活率(P＜0.05),并且提高细胞中活化caspase 3的表达(P＜0.05).结论 在神经元细胞中过表达LRG能通过激活PI3K/Akt信号途径降低细胞在类缺血再灌注中的损伤.
关键词： 神经元细胞 脂多糖应答基因 1-磷脂酰肌醇3-激酶 活化蛋白激酶B 再灌注损伤 -
以细胞凋亡指数为指标研究视网膜神经元细胞损伤中存在的问题
笔者在近几年的审稿、研究生学位论文答辩和文献阅读中，注意到在部分涉及以细胞凋亡和细胞凋亡指数为指标，评价视网膜神经元细胞受损伤情况的基础研究工作，尤其以末端核苷酸转移酶介导的生物素dUTP切口末端标记(TDT-mediated biotinylated-dUTP nick-end labeling,TUNEL)技术原位观察细胞凋亡和以此为基础计算细胞凋亡指数的研究工作中，存在一些明显且原则性的问题，集中表现为TUNEL技术的显色结果图片质量较低，无法反映细胞凋亡概念中所述的基本表现，由此计算的细胞凋亡指数缺乏准确性和可重复性。
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肝豆状核变性神经系统损害的临床观察
目的 观察及研究肝豆状核变性(HLD)的神经系统损害.方法 回顾性分析确诊HLD40例患者的临床资料.结果 发病患者年龄小6岁,大25岁,33例有锥体外系表现,22例有锥体系损害,16例有精神症状,32例有智能障碍,30例有自主神经损害.结论 HLD的神经系统表现复杂多变,只有加深对本病的认识,才能提高早期诊断水平.
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BDNF-GFP转染神经干细胞对脊髓损伤大鼠BDNF表达的影响
目的 探讨脑源性神经营养因子(Brain-Derived Neurotrophic Factor,BDNF)和绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)转染后神经干细胞(Neural Stem Cells,NSCs)移植对脊髓损伤大鼠BDNF表达的影响.方法 以携带BDNF-GFP基因的腺病毒转染NSCs,免疫组化及Western blot检测转染后NSCs BDNF表达.40只Wistar大鼠中假手术组8只,32只大鼠制成T9左侧横断模型,并随机分成四组:BDNF和GFP修饰的N-SCs移植组、GFP修饰的NSCs移植组、单纯NSCs移植组和模型组.在各NSCs移植组,脊髓损伤后向横断处显微注射等体积细胞,模型组在相同的部位注射等体积的PBS.实时定量PCR检测各实验组BDNF表达情况.结果 免疫组化显示BDNF-GFP转染的NSCs可表达BDNF(黄色荧光).Western blot结果显示BDNF-GFP转染的NSCs可表达相对分子质量约为41kU的融合蛋白条带.NSCs移植可使BDNF的表达量明显增高(P＜0.05或P＜0.01),以BDNF-GFP转染的NSCs移植组BDNF表达量高(P＜0.01).结论 BDNF-GFP转染后NSCs可在脊髓半切模型中存活并高表达具有生物活性的BDNF.
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实验性糖尿病大鼠心迷走神经及其心神经节结构变化的研究
目的 对糖尿病心脏自主神经的病理生理变化进行深入研究,阐明糖尿病心脏自主神经病变的病理基础.方法采用神经示踪技术顺行标记实验性糖尿病大鼠模型的心迷走传出神经纤维及其支配的心脏神经节的神经纤维末端;同时采用荧光金染料标记心神经节神经元细胞,通过荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察其结构的改变.结果 (1)糖尿病大鼠心脏神经元细胞胞体变小,细胞间隙模糊;(2)Dil标记的迷走神经传出纤维直径变细,伴局部肿胀;(3)被心脏迷走神经传出纤维所支配的心脏神经元细胞明显减少.结论糖尿病可导致心脏神经节细胞结构的改变,并减少迷走神经传出纤维对神经节细胞的支配活动,这种改变可能与糖尿病患者心血管压力反射敏感性的下降有关.
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Notch和BMP信号通路介导红景天苷促进小鼠骨髓间充质干细胞向神经元细胞定向分化研究
目的 探讨BMP和Notch信号通路介导红景天苷诱导骨髓间充质于细胞(MSCs)向神经细胞定向分化的分子机制.方法 实验分为对照组、红景天苷诱导组和阻断组.利用细胞免疫荧光化学方法、Real-Time PCR方法和Western blotting方法分别研究了红景天苷对MSCs的增殖、形态以及对BMP和Notch信号通路的影响.结果 红景天苷影响MSCs的增殖且促进其形成神经元样细胞;细胞免疫荧光结果显示,红景天苷可降低Notch1和Jadge1阳性表达率(P＜0.05);红景天苷诱导细胞12～72 h时,Notch1和Hesl mRNA表达丰度明显下调(P＜0.05);特异性阻断剂DAPT阻断Notch信号通路后,神经元细胞标志分子NSE、MAP-2和β-tubulin Ⅲ mRNA和NSE、β-tubulin Ⅲ蛋白的表达水平与阻断前比较显著上调(P＜0.05).12h时Smad5和Smad8 mRNA的表达水平显著上调(P＜0.01),且12和24 h时Smad l/5/8蛋白表达上调(P＜0.05);Noggin阻断BMP信号通路后,NSE、MAP-2和β-tubulin Ⅲ mRNA的表达丰度与诱导组比较明显下调(P＜0.05);DAPT和Noggin同时阻断Notch和BMP信号通路后,与单独阻断BMP信号通路后比较,MAP-2和β-tubulin Ⅲ mRNA的表达上调,NSE和β-tubulin Ⅲ蛋白的表达水平上调(P＜0.05).结论 红景天苷通过抑制Notch信号通路、激活BMP信号通路诱导MSCs向神经元细胞定向分化.
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脑电图头皮电场的表现形式及判读程序
神经元细胞在代谢活动中伴随产生的细胞外电流同步化是头皮电场的形成基础,脑电图是头皮电场的表现形式,有序地判读脑电图是临床脑电图工作的重要组成部分.
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阿司匹林对缺氧/缺糖大鼠皮质神经元细胞线粒体膜电位的影响
目的 观察大鼠皮质神经元细胞在缺氧/缺糖(OGD)时线粒体膜电位(MMP)的变化及阿司匹林的保护作用.方法 取体外培养7 d的Wistar大鼠皮质神经元细胞,随机分为正常对照组、缺氧/缺糖模型组、缺氧/缺糖加阿司匹林组.缺氧/缺糖2 h后在常氧下继续培养24 h.流式细胞术检测不同时间段神经元细胞线粒体膜电位.结果 缺氧/缺糖损伤2 h,缺氧/缺糖组线粒体膜电位水平较正常对照组显著降低(P<0.01).缺氧/缺糖加阿司匹林组皮质神经元细胞在缺氧2 h及再复氧24 h后细胞线粒体膜电位明显高于缺氧/缺糖模型组(P<0.01).结论 阿司匹林可抑制缺氧/缺糖损伤所致的线粒体膜电位的降低,从而具有稳定线粒体膜电位的作用,抑制神经细胞凋亡的发生.
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祛风通窍方可通过改善血管性痴呆大鼠海马区神经元细胞改善记忆力
目的:观察“祛风通窍方”对血管性痴呆大鼠海马及额叶皮层神经元细胞变化的影响及作用机制.方法:用Morris水迷宫筛选符合要求SD大鼠60只,随机分为假手术组、模型组、阳性组、祛风通窍方高、中、低剂量组每组各10只.手术组采用2-VO法制备模型,造模1月后,阳性组予尼莫地平6.25 mg/(kg ·d)灌胃,祛风通窍方高、中、低剂量组分别给予祛风通窍方26.8 g/(kg·d)、13.4 g/(kg·d)、6.7g/(kg·d)灌胃,假手术组、模型组予等体积蒸馏水灌胃,连续30 d.心脏灌注内固定,取脑组织,观察各组大鼠海马CA1区锥体细胞及额叶皮层神经元线粒体的变化.结果:光镜下海马CA1区锥体细胞变化:与假手术组比较,模型组锥体细胞丢失明显,细胞1～2层,排列散乱;界限不清,大量细胞变形,核固缩碎裂、呈深蓝色、胞浆浓缩;与模型组比较,尼莫地平组及高、中剂量组锥体细胞层次、排列、形态得到了明显改善.电镜观察额叶皮层神经元线粒体变化:与假手术组比较,模型组线粒体明显水肿破裂,线粒体嵴结构不清晰,线粒体部分固缩;与模型组比较,尼莫地平组,祛风通窍方高、中剂量组线粒体受损情况得到了明显改善.结论:“祛风通窍方”可明显改善血管性痴呆大鼠海马CA1区锥体细胞形态及额叶皮层神经元线粒体的超微结构.
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脂肪基质细胞诱导分化为神经元细胞的实验
背景:寻找合适的种子细胞是移植治疗脑血管疾病及其他中枢神经系统疾病的关键.目的:观察人脂肪组织来源的基质细胞分化为神经元细胞的能力.方法:脂肪组织取自要求去除腹部多余脂肪的健康成人,供者无传染性疾病和内分泌疾病.分离培养脂肪组织来源的基质细胞,采用神经诱导培养基加GM1对其进行诱导培养.倒置相差显微镜下连续观察细胞生长情况和形态变化,免疫组织化学法鉴定神经前体细胞的特异性标志神经巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶和微管联合蛋白2的表达情况.结果与结论:①经神经诱导培养基加GM1诱导后,分化后的细胞大部分呈典型的神经元样细胞形态.②倒置相差显微镜下可见,于诱导后1 h出现神经巢蛋白表达阳性,5 h出现神经元特异性烯醇化酶和微管联合蛋白2表达阳性.提示脂肪基质细胞可分化为神经元细胞,分化后的神经元细胞具有表达神经巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶和微管联合蛋白2的功能.
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牙髓干细胞共培养改善1-甲基-4-苯基吡啶离子诱导的神经元凋亡
背景:如何利用牙髓干细胞改善神经损伤对于神经退行性疾病的临床治疗具有重要的意义.目的:探讨牙髓干细胞共培养对1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenyl pyridinium,MPP+)诱导的神经元凋亡的影响.方法:分离培养人牙髓干细胞,进行形态观察和成脂成骨诱导分化能力鉴定;分离中脑神经元细胞,利用Transwell小室进行牙髓干细胞和神经元共培养,然后加入MPP+干预48 h,通过Tunel染色和western blot法检测牙髓干细胞对MPP+诱导的神经元凋亡的影响.结果与结论:①牙髓干细胞形态呈梭形,且能够成功向成脂成骨方向诱导分化;②牙髓干细胞和神经元细胞共培养后,减轻了 MPP+诱导的神经元凋亡;③MPP+处理后降低了 Bcl-2的表达,促进了 Bax 和 cleaved caspase3的表达,而在牙髓干细胞共培养条件下,抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显上升,促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase3表达明显下降;④结果表明,人牙髓干细胞可以保护或修复体外MPP+诱导的神经元损伤,该保护作用可能是通过人牙髓干细胞的旁分泌作用来实现的.
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aFGF对染铅大鼠海马神经元细胞浆ERK活性的保护作用
目的:探讨酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)对染铅的原代培养大鼠脑神经元细胞外调节蛋白激酶(ERK)活性的影响.方法:神经元培养4～8 d后,用0.6μg/L aFGF及不同浓度铅处理细胞,用改良Takai法测定ERK活性.结果:神经元染铅30 min,在0.1～2.0μmol/L铅浓度范围内,ERK比活性明显升高,呈浓度依赖性,尤其1.0～2.0μmol/L时高.用aFGF预处理后再染铅时,在1.0～5.0μmol/L时ERK比活性与对照组比较无明显差异.结论:ERK比活性随着染铅浓度不同而发生改变.aFGF可保护神经元避免铅对ERK活性的影响.
关键词： 神经元细胞 铅 细胞外调节蛋白激酶 酸性成纤维细胞生长因子
