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RNR3调控的重组绿色荧光蛋白酵母细胞对化学诱变原的高通量筛选
目的 用RNR3调控的全发光酵母细胞高通量筛选化学诱变原.方法 以含有酵母嗜好遗传密码子的绿色荧光蛋白(yEGFP)报告载体为基本框架,用PCR方法从酵母(W303-1A)基因组扩增RNR3启动子,将其插入到yEGFP的上游,从而构建成RNR3调控的yEGFP酵母报告载体.用醋酸锂方法将载体转化于酵母细胞,构建成RNR3调控的yEGFP发光酵母细胞,可在96孔板中对不同浓度的化学诱变原进行筛选,具有快速、方便和高通量特点.结果 对数种不同的DNA损伤药物研究结果表明,DNA烷化剂(甲磺酸甲脂)、DNA断裂剂(顺铂)、DNA结合剂(放线菌素D)和DNA合成酶抑制剂(5-氟尿嘧啶和羟基脲)可诱导RNR3的表达,而苯丁酸氮芥和4-硝基-N-氧化喹啉由于细胞的毒性的作用,未使RNR3发生表达.结论 某些与致癌性有关的DNA损伤化学物能诱导RNR3表达,故该发光酵母细胞可用于对某些致癌物的高通量筛选.
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RNR2调控的重组绿色荧光蛋白酵母细胞的构建及其对化学诱变原的高通量筛选
目的 建立RNR2调控的酵母增强绿色荧光蛋白(yEGFP)发光酵母细胞,高通量筛选化学诱变原.方法 用PCR方法从酵母(W303-1 A)基因组扩增RNR2启动子,经酶切后,用T4连接酶与线性化的含酵母嗜好遗传密码子的yEGFP报告载体相连,连接产物转化子质粒经酶切和测序鉴定,构建RNR2调控的yEGFP酵母报告载体.用醋酸锂方法将其转化于W303-1 A酵母细胞,从而构建成RNR2调控的yEGFP发光酵母细胞(W303-1 A/RNR2-yEGFP).用甲磺酸甲酯0～400 mg· L-1分别作用于该发光酵母细胞0,4,8,12,16和20 h后,于倒置荧光显微镜下观察荧光,用多功能酶标仪检测其荧光发光强度,选择佳诱导时间；用不同浓度的DNA烷化剂、DNA断裂剂和DNA合成酶抑制剂作用于该重组细胞16h,检测其荧光发光强度,考察W303-1 A/RNR2-yEGFP细胞对各种化学诱变原的敏感性.结果 经测序确定W303-1 A/RNR2-yEGFP构建成功.选择16 h为佳诱导时间；各种化学诱变原与W303-1 A/RNR2-yEGFP细胞作用16h后,与DNA发生结合的化合物中放线菌素D和溴乙锭诱导的发光度与对照组无明显差别,发光倍数＜1.5；与DNA发生烷基化的化合物中,甲磺酸甲脂200 mg· L-1诱导的细胞发光度强,发光倍数为5.21,瘤可宁200 μg· L-1诱导的发光倍数为1.9,而丝裂霉素C的发光度与对照组无明显差别.在使DNA发生断裂的诱变原中,顺铂250 mg· L-1诱导的细胞高发光倍数为3.7,其次4-硝基-N-氧化喹啉3.1 mg·L-1、博来霉素12.5 mg·L-1和福来霉素200 mg· L-1,高诱导倍数分别为2.35,2.26和2.53;在抑制DNA合成酶或拓扑异构酶的诱变原中,5-氟尿嘧啶500 μg· L-1、羟基脲570.45 mg· L-1和喜树碱30 mg,L-1所诱导的细胞大发光倍数分别为2.36,2.65和2.53;而非基因毒性化合物秋水仙碱、刀豆氨酸和四环素诱导的发光度与对照无明显差别.结论 该重组发光酵母细胞可用于对多数造成DNA断裂或合成阻断的化学诱变原筛选,具有快速、方便和高通量等特点.
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筛选化学诱变原的RNR3调控重组Lac Z基因酵母细胞的建立
目的：建立可筛选化学诱变物的RNR3调控重组Lac Z基因酵母细胞。方法：利用降式PCR技术从酵母基因组中扩增RNR3启动子，将其插入到pMP206/ERE酵母报告载体，构建成RNR3调控的Lac Z酵母报告载体，将该载体转入W303-1A酵母细胞，构建成RNR3调控的重组Lac Z基因酵母细胞。用数种化学诱变原作用于该重组基因酵母细胞，观察其对RNR3的诱导表达。结果：放线菌素D、丝裂霉素C、阿非迪霉素和溴乙锭不能诱导RNR3的表达，而甲磺酸甲脂、瘤可宁、顺铂、4-硝基-N-氧化喹啉、博来霉素、福莱霉素、5-氟尿嘧啶、喜树碱和羟基脲诱变原与RNR3表达有明显的剂量效应关系。结论：该重组酵母可用于对多种化学诱变原的快速筛选。
