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Bex2抑制神经胶质瘤细胞凋亡及其与 JNK/MAPK 通路关系的研究
目的：研究 Bex2对神经胶质瘤细胞凋亡的影响并探讨其作用机制，为胶质瘤的基因治疗提供理论和实验依据。方法①利用前期构建 pEGFP-N1- Bex2真核表达载体，脂质体转染法过表达 Bex2后12、24、48、72 h 收集 U251神经胶质瘤细胞，用流式细胞术检测细胞凋亡率，用免疫印迹法检测 Bex2基因的表达及活化型 caspase-3、p-JNK、p-c-Jun 的变化。②收集临床神经胶质瘤手术标本，通过免疫组织化学检测 Bex2、活化型caspase-3、p-JNK、p-c-Jun 蛋白的表达，并与正常脑组织比较，分析它们之间的相关关系。结果①流式细胞术检测结果显示，过表达 Bex2后12、24、48、72 h 各时间点细胞凋亡率明显低于空载体组（P<0.05），转染48 h 组低于其他时间点组（P<0.05）。免疫印迹法检测表明，转染后48 h 细胞的活化型 caspase-3、p-JNK、p-c-Jun 含量较空载体组和空白对照组降低（P<0.05）。②免疫组织化学结果表明，神经胶质瘤组织较正常脑组织中 Bex2表达增高，活化型 caspase-3、p-JNK、 p-c-Jun 蛋白低表达（P<0.05）。结论 Bex2在神经胶质瘤组织中高表达，并通过下调 JNK/MAPK 通路活性抑制胶质瘤细胞凋亡，进而促进肿瘤的发生和发展。
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真核表达质粒pEGFP-N1-Bex2的构建及其在U251细胞中的表达
目的 构建pEGFP-N1-Bex2真核表达质粒,并探索其在U251神经胶质瘤细胞中的表达.方法 以正常人脑组织总RNA为模板,采用RT-PCR法获得Bex2的cDNA,并与pEGFP-N1载体连接,构建pEGFP-N1-Bex2真核表达质粒.对pEGFP-N1-Bex2重组质粒的菌液行PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定.在U251细胞中用脂质体转染法转染pEGFP-N1-Bex2真核表达载体过表达Bex2,分别于转染后12、24、48、72 h收集细胞,用Western blot检测Bex2基因的表达情况.结果 真核表达质粒pEGFP-N1-Bex2经PCR及双酶切鉴定,均可见387 bp的目的基因条带,并单倍正向克隆至质粒中.转染质粒pEGFP-N1-Bex2后荧光显微镜下观察U251细胞内有绿色荧光蛋白表达,Western blot检测见47 KD和26 KD分别有清晰的外源性Bex2-GFP融合蛋白和GFP蛋白的表达.pEGFP-N1-Bex2在转染U251细胞后12h即有表达,48 h达到高峰.结论 成功构建pEGFP-N1-Bex2真核表达质粒,瞬时转染后在U251细胞中顺利表达.
