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HPV16E6mRNA、P21ras和c-myc蛋白在子宫颈鳞癌中表达的意义
目的:研究宫颈癌的分子发病机制,进一步阐明相关致癌因素和癌基因在子宫颈鳞癌发病中的作用,为治疗和预防提供依据.方法:采用PCR、ISH和IHC方法研究了51例子宫颈鳞癌组织的HPV16感染、HPV16E6mRNA、P21ras和c-myc蛋白表达的分布.进而阐明HPV16感染和P21ras、c-myc蛋白表达对反映子宫颈鳞癌发病中的意义.结果:51例标本中HPV16感染38例,HPV16E6mRNA阳性表达者35例,P21ras和c-myc蛋白阳性表达率分别为60.8%和76.5%.结论:HPV16感染与P21ras、c-myc蛋白积累无关,而P21ras与c-myc蛋白表达则显著相关.提示癌基因活化或HPV16感染等因素协同作用在子宫颈癌的发生发展中有重要意义.
关键词： 子宫颈癌 人乳头瘤病毒16型(HPV16) 癌基因 -
复方排毒止带汤含药血清对人宫颈鳞癌SiHa细胞人乳头瘤病毒16型E6,E7,p53,Rb蛋白表达的影响
目的 采用蛋白免疫印迹法(Western Blot)研究中药复方排毒止带汤含药血清对人宫颈鳞癌SiHa细胞人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6,E7,p53,pRb蛋白表达的影响.探讨复方排毒止带汤对人乳头瘤病毒的影响.方法 将大鼠随机分为空白对照组、25％含药血清组及50％含药血清组.空白对照组口服生理盐水,25％含药血清组及50％含药血清组口服复方排毒止带汤煎剂,将复方排毒止带汤25％含药血清和50％含药血清分别作用于SiHa细胞72,120 h后,采用Western Blot法检测HPV16 E6,E7,p53,pRb蛋白表达,采集数据.统计学分析采用独立样本t检验.结果 复方排毒止带汤50％含药血清作用72 h,HPV16 E6,E7蛋白表达水平下降,p53,pRb蛋白表达水平升高,复方排毒止带汤50％含药血清作用120 h,HPV16 E6,E7蛋白表达水平较作用72 h明显下降,p53,Rb蛋白表达水平明显升高,2组相应指标比较P均＜0.05,差异有统计学意义.复方排毒止带汤25％含药血清作用120 h,HPV16 E6,E7蛋白表达水平下降,p53,Rb蛋白表达水平上升,复方排毒止带汤50％含药血清作用120 h HPV16 E6,E7蛋白表达水平较25％含药血清明显下降,p53,Rb蛋白表达水平明显升高,2组相应指标比较P均＜ 0.05,差异有统计学意义.结论 复方排毒止带汤含药血清对HPV16 E6,E7,p53,Rb蛋白表达具有明显调控作用,复方排毒止带汤的活性具有一定的时效性.
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人乳头瘤病毒16型E5蛋白真核载体的构建及表达
目的 构建人乳头瘤病毒16型(HPV16)E5蛋白真核表达载体pcDNA3.1(+)/HPV16 E5,分析E5在HeLa细胞及BALB/c小鼠肌肉组织中的表达.方法 设计HPV16 E5基因引物,PCR扩增E5基因,经BamHI、EcoRI酶切后将其连接入pcDNA3.1(+),PCR及双酶切筛选阳性克隆并测序.将构建的pcDNA3.1(+)/HPV16 E5转染HeLa细胞,利用RT-PCR测定HPV16 E5 mRNA表达.将6只BALB/c小鼠分为3组,分别取100 mg pcDNA3.1(+)/HPV16 E5、100 mg pcDNA3.1(+)、100 mL PBS经肌肉注射小鼠,2周1次,共4次；末次接种后第14天取小鼠股四头肌制成石蜡切片,免疫组织化学法检测E5蛋白在小鼠肌肉组织中的表达.结果 PCR扩增得到252 bp HPV16E5基因片段,DNA测序结果显示E5基因片段正确地连入pcDNA3.1(+).构建的pcDNA3.1(+)/HPV16 E5在HeLa细胞表达大小为252bp的HPV16 E5 mRNA.小鼠股四头肌细胞膜被染成棕黄色.结论 构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)/HPV16 E5能在HeLa细胞及小鼠肌肉组织中表达HPV16 E5蛋白.
关键词： 人乳头瘤病毒16型(HPV16) E5 表达 -
免疫渗滤法实验中非特异性染色封闭方法的改进
目的 选择理想的非特异性抗原封闭方法以适应基于免疫渗滤法的蛋白芯片制备.方法 以杆状病毒-昆虫表达系统制备的人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1蛋白抗原为例,采用脱脂奶粉、小牛血清、牛血清白蛋白及不同组合等5种方法对非特异性抗原进行封闭,检测其在免疫渗滤实验中对消除非特异性染色的效果,寻找佳封闭非特异性染色的方法.结果 经过多次重复试验,并以PBS代替血清作空白试验,结果显示,目前常用的先固相然后封闭的几种方法,其封闭效果的稳定性和重复性不佳,且空白对照易出现假阳性;同时发现使用脱脂奶粉做封闭剂封闭后,由于奶粉颗粒易堵塞NC膜的孔径,影响NC膜的渗滤速度;使用小牛血清做封闭剂封闭后,由于NC膜对小牛血清的吸附而产生背景,影响结果判读;而采用20g/L BSA先封闭后固相的方法,在实验中得到满意的结果.结论 先封闭后固相的方法,在免疫渗滤实验中对非特异性抗原封闭的效果理想、结果稳定、重复性好,为一种理想的新的封闭方法.
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人乳头瘤病毒16型E5与IL-12联合基因疫苗的免疫活性
为了研制人乳头瘤病毒16型(HPV16)防治性疫苗,分析了HPV16 E5与IL-12联合基因疫苗的免疫活性.将构建的pcDNA3.1(+)/E5与pcDNA3.1(+)/IL - 12联合免疫BALB/c小鼠,以ELISA测定小鼠血清中抗HPV16 E5 IgG水平、小鼠脾细胞培养上清中IFN-y和IL- 4含量；MTT法检测脾淋巴细胞增殖反应.结果显示末次免疫后,联合基因疫苗组和单基因疫苗组血清IgG A450值分别明显高于pcDNA3.1(+)组、pcDNA3.1(+)/IL-12组和PBS组(P＜0.01)；且联合基因疫苗组显著高于单基因疫苗组(P＜0.01).联合基因疫苗组和单基因疫苗组的IFN-γ和IL-4含量分别均明显高于pcDNA3.1(+)组、pcDNA3.1(+)/IL-12组和PBS组IFN-γ和IL-4含量(P＜0.01),且联合基因疫苗组含量显著高于单基因疫苗组(P＜0.01).联合基因疫苗组和单基因疫苗组脾淋巴细胞刺激指数(SI)分别显著高于pcDNA3.1(+)组、pcDNA3.1(+)/IL-12组和PBS组(P＜0.01)；联合基因疫苗组与单基因疫苗组比较,SI差异无统计学意义(P＞0.05).结果表明HPV16 E5单基因疫苗以及与IL-12联合基因疫苗均能刺激机体产生较强的免疫应答,且联合基因疫苗优于单基因疫苗.
关键词： 人乳头瘤病毒16型(HPV16) E5 IL-12 疫苗
