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应用细胞培养、流式细胞技术和Western Blot检测氮杂糖化合物SZL在体外抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖与诱导凋亡的效应
目的:存在于细胞表面的糖复合物参与细胞的通讯、增殖、迁移、分化等生理过程,在机体中具有复杂的生物学调控作用.探讨氮杂糖化合物SZL在体外对人宫颈癌HeLa细胞生长、DNA损伤、线粒体膜电位以及细胞凋亡的干预.方法:实验于2004-12/2006-12在北京大学医学部细胞生物学系完成.①实验材料:人子宫颈癌HeLa细胞株由北京大学医学部细胞生物学系杜晓娟副教授提供.SZL由北京大学天然药物及仿生药物重点实验室叶新山教授合成.②实验方法:取对数生长期HeLa细胞,消化后制成细胞悬液,按1.5×103/孔的密度接种,培养24 h细胞完全贴壁后,SZL组加入5.10,25,50,100 μmol/L的SZL,空白对照组加入DMEM培养液.③实验评估:SZL作用24,48,72 h后,采用酸性磷酸酶法检测细胞生长抑制情况,瑞氏染色镜下观察细胞形态;AnnexinV-PI染色后,流式细胞仪检测细胞凋亡率;Rhodamine123标记活细胞后,流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化;Western Blot法检测SZL作用后凋亡相关蛋白的表达;单细胞凝胶电泳检测SZL作用后细胞DNA损伤情况.结果:①细胞生长抑制:5,10,25,50,100 μmol/L SZL作用24,48,72 h后的半数抑制浓度分别为73.6,43.2,33.6 μmol/L,显著抑制Hela细胞的增殖.镜下空白对照组HeLa细胞分布均匀,胞质透明清亮,呈铺展状态生长;50 μmol/L SZL作用24 h后,HeLa细胞密度变稀,体积变小,胞核染色质呈聚集状态.②细胞凋亡:50,100 μmol/L SZL作用24 h后细胞凋亡率分别为(3.51±0.41)%,(58.46±8.45)%;在24～48 h过程中,凋亡的细胞逐渐坏死,SZL作用48 h后细胞凋亡率分别为(10.51±2.20)%,(17.29±7.52)%.空白对照组24,48 h后细胞凋亡率均为1%.③线粒体跨膜电位的变化:50 μmol/L SZL作用24,48 h后,HeLa细胞的线粒体膜电位平均荧光强度均明显低于空白对照组(P＜0.01).④凋亡相关蛋白的表达:25,50,100 μmol/L SZL作用HeLa细胞48 h后,凋亡相关蛋白pro-caspase3、Bcl-2表达降低,细胞色素c含量升高.⑤细胞DNA损伤;50 μmol/L SZL作用24 h后,受损细胞DNA在电场中迁出,呈现彗星状拖尾.结论:氮杂糖类化合物SZL能够抑制HeLa细胞的增殖,诱导细胞发生DNA损伤,通过干预线粒体途径实现细胞凋亡.
